Информация

Отстраняване на първоначалния метионин във Венера за FRET

Отстраняване на първоначалния метионин във Венера за FRET



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Работя по създаването на някои репортери на FRET. В допълнение към мястото на разцепване (с различен състав от 15-18AA), 1 AA линкер, използвам Venus и Cerulean.

Първоначално се притеснявах, че 18AA ще бъде твърде дълъг, но всъщност дава справедлив сигнал. За справка смятам, че радиусът на Фьорстер (Ro) е 54Å.

Сега работя върху допълнителна оптимизация. Отстраняването на първоначалния метионин причинява ли някакви проблеми за Венера, ако е вторият протеин в двойката FRET? Основното оформление е:

Cerulean - Връзка - Разцепване - Връзка - Венера

И се чудя дали срязването на Met от Венера може да ме доближи с 1 AA и следователно малко по-добър сигнал. Виждал съм го публикуван и по двата начина и се чудех дали някой е опитвал и двете или просто е знаел теоретично, че няма да има значение.


Активираният Ras протеин ускорява прогресията на клетъчния цикъл, за да наруши цистогенезата на кучешкия бъбрек на Madin-Darby*

В редица човешки ракови клетки K-RAS често мутира и се активира конститутивно, което завършва с индуциране на непрекъснат клетъчен растеж, отличителен белег на раковите клетки. Все още не е ясно обаче как мутиралият K-RAS предизвиква морфологични аномалии в раковите тъкани. За да изследваме механизма, лежащ в основата на K-RAS-индуцираните морфологични промени, ние използвахме ауксин-зависима протеинова експресионна система, която ни позволи бързо да индуцираме и оценим конститутивно активен K-Ras в кисти на MDCK (Madin-Darby кучешки бъбрек), модел за поляризирана епителна структура. Клетки, носещи конститутивно активен KRasV12 генът са морфологично неразличими от нормалните клетки в двуизмерна култура. Въпреки това, в гел от извънклетъчен матрикс, KRasV12-експресиращите клетки не успяват да образуват сферична киста. Когато индукцията на KRasV12 се забави до образуването на киста, някои клетки в стената на кистата загубиха полярност и бяха екструдирани в и натрупани в луминалното пространство. С ефектор-специфични мутанти на KRasV12 и инхибитори за MEK и PI3-киназа, ние открихме, че осите Raf-MEK-ERK и PI3-киназа са необходими и достатъчни за този фенотип. Изобразяването на живи клетки с индикатори на клетъчния цикъл показва, че експресията на KRasV12 насърчава прогресията на клетъчния цикъл, което е предотвратено или от инхибитори на MEK или PI3-киназа. От тези резултати ние предоставяме модел, при който активният-Ras индуцира прогресия на клетъчния цикъл, водеща до апикална клетъчна екструзия чрез Raf и PI3-киназа по кооперативен начин. Разработената тук система може да се приложи за скрининг на лекарства за различни видове рак, произхождащи от епителни клетки.

Тази работа беше подкрепена от грантове от Министерството на образованието, културата, спорта, науката и технологиите на Япония и Мемориалната фондация за медицински и фармацевтични изследвания Mochida.

Подкрепено от изследователски стипендии от Японското дружество за насърчаване на науката за млади учени.


Инструменти за една молекула, част B: Методи, базирани на супер разделителна способност, проследяване на частици, многопараметърни и силови методи

Майкъл А. Томпсън,. W.E. Moerner, в Методи в ензимологията, 2010

2.4 EYFP като фотопревключващ излъчвател

Използването на EYFP като фотопревключващ излъчвател значително разширява броя на биологичните образци, които са незабавно достъпни за изображения със супер разделителна способност. В повечето докладвани изображения на PALM, фотоактивируемият флуоресцентен протеин е избран от различни сложни конструкции като PA-GFP, Dronpa, Kaede, tdEosFP, Dendra2, rsFastLime, PA-mCherry и rsCherryRev ( Betzig et al., 2006 Гайслер et al., 2007 Ниу и Ю, 2008 Стил et al., 2008 Субач et al., 2009 г.). Въпреки това е показано, че единични имобилизирани и очевидно избелени жълти FPs (S65G, S72A, T203Y или S65G, S72A, T203F) се активират отново с виолетова светлина преди повече от 10 години (Dickson et al., 1997 г.), а тясно свързаният усилен жълт флуоресцентен протеин EYFP (S65G, V68L, S72A, T203Y) наскоро беше използван за изобразяване на живи клетки на PALM на C. crescentus структурен протеин MreB ( Biteen et al., 2008 г.). EYFP се използва широко за рутинни флуоресцентни протеинови сливания поради отсъствието на физиологични смущения като агломерация и неправилна локализация, а N-терминалните EYFP-MreB сливания са показали, че са функционални в C. crescentus и други бактерии, което прави това физиологично релевантна система (Carballido-López and Errington, 2003 Figge et al., 2004 Гитай et al., 2004). Освен това, едномолекулното изображение на EYFP-MreB с 514-nm възбуждане по-рано показа, че този флуоресцентен протеин е ярък едномолекулен емитер за изображения на живи клетки (Kim et al., 2006 ).

Фигура 2.5 показва фотореактивиране на EYFP в живи клетки ( Biteen et al., 2008 г.). Фигура 2.5A показва единична рамка за изображения, където флуоресцентното изображение е насложено върху изображение с отрицателен контраст на предаване на бяла светлина на C. crescentus клетка. Две единични EYFP-MreB молекули могат да бъдат идентифицирани в панел А, който е получен след първоначалната стъпка на избелване. След допълнително изобразяване с 514-nm светлина, всички флуорофори са избелели, както се наблюдава в панел B. Реактивирането на EYFP беше постигнато след тази първоначална стъпка на избелване чрез прилагане на 2-секундна доза от 407-nm лазерно осветление. Тази дължина на импулса, както и интензитетът на реактивиране от 10 3 –10 4 W cm − 2, са избрани така, че най-много една EYFP молекула да се активира отново във всяка област с ограничена дифракция и да се активира различен подгрупа от EYFP молекули в всеки цикъл на този процес.

Фигура 2.5. Реактивиране на EYFP-MreB сливания в живи клетки на C. crescentus. (A) Единични 100-ms кадри за придобиване, показващи изолирани EYFP-MreB молекули (a, c и e) при фотоактивиране и липса на емисия на единична молекула (b, d, f) след фотоизбелване. Мястото в долния ляв ъгъл на всяко изображение е артефакт на изображението. (B) Масово реактивиране на проба от 22 клетки. Сивите линии показват 2-секундни импулси от 407 nm светлина. (Адаптирано и възпроизведено с разрешение от Biteen et al., 2008 г. Авторско право 2008 Nature Publishing Group.)

На фиг. 2.5В общият интензитет на излъчване от 22 живи C. crescentus клетки, експресиращи EYFP-MreB, се показва като функция на времето. След първоначален период на избелване между циклите на изобразяване бяха приложени проблясъци с енергия на активиране 407 nm. Тези цикли на реактивиране бяха използвани за изчисляване на квантовия добив на фотореактивация на EYFP флуорофора. Измерената връзка между времето на активиране и процента на повторно активиране може да се начертае и е квазилинейна. При измервания на EYFP-MreB в живо C. crescentus клетки, 370 фотона се абсорбират от всяка EYFP молекула в секунда от импулса на активиране. От наклона на участъка е намерен реактивационен квантов добив от 1,6 × 10 –6 за EYFP ( Biteen et al., 2009 г.). Това число е от същия порядък като квантовия добив на активиране за PA-GFP и само с 1 порядък по-малък от квантовия добив на фотопревключване на високо инженерния протеин, tdEos (виж Таблица 2.1). Следователно EYFP може да се разглежда като полезен фотопревключващ флуорофор за изображения със супер разделителна способност.


Въведение

Centralspindlin е еволюционно запазен, конститутивен 2:2 хетеротетрамерен комплекс от кинезин-6 субединица MKLP1 и немоторна субединица CYK4. В тази статия ще използваме термина „MKLP1“, за да обозначим колективно ортолозите на KIF23/MKLP1 на бозайниците [1], като напр. Caenorhabditis elegans ZEN-4 и терминът “CYK4” за обозначаване на ортолозите на ° С. elegans CYK-4 [2], като RACGAP1/MgcRacGAP при бозайници [3]. Централният шпинлин играе съществена роля в цитокинезата чрез образуване на структури на снопчета на микротубулите на централното вретено и средното тяло, чрез набиране и регулиране на различни фактори на мястото на делене и чрез закотвяне на плазмената мембрана в междуклетъчния мост, докато дъщерните клетки чакат абсцисия [4-11 ]. Точкова мутация в KIF23/MKLP1 е причина за вродена дизеритропоетична анемия тип III, която се характеризира с големи многоядрени еритробласти в костния мозък [12]. И двете субединици MKLP1 и CYK4 са от съществено значение за свързването на микротубулите чрез централен спиндлин [3,13]. In vitro нито MKLP1 самостоятелно, нито CYK4 могат ефективно да свързват микротубули. In vivo изчерпването на компонентни или точкови мутации, които влияят върху образуването на хетеротетрамер на централния шпиндлин, причиняват дефекти на централното вретено [2,3,14–19]. Поразително, въпреки че генетични екрани в ° С. elegans за супресори на такива разрушаващи комплекса мутации (S15L в CYK-4 или D520N в ZEN-4) досега са идентифицирани 15 независими точкови мутации, всички се намират в ограничени региони CYK-4 12–39 и ZEN-4 477–515. Вероятно тези открития определят свързващите интерфейси между тези субединици [3,13] (обобщени на фигура 1А). Те са включени в минималните домейни на CYK-4 и ZEN-4, достатъчни за ин витро възстановяване на стабилния комплекс между тях (CYK-4 1–120 и ZEN-4 435–555). Тези данни подчертават важността на образуването на хетеротетрамер за свързване на микротубули и предполагат, че сглобяването на тетрамера се постига чрез компактни домейни без обширен контакт, като дълъг сноп с четири спирали. Въпреки това, остава неясно как CYK4 допринася за свързването на микротубулите.

(A) Схема на доменните структури на CYK-4 и ZEN-4 и техните фрагменти, експресирани като слети протеини с етикети за пречистване, които бяха отстранени по време на пречистването. Пурпурните и цианите вертикални сегменти означават остатъците, чиято мутация нарушава взаимодействието CYK-4–ZEN-4 и чиято мутация съответно потиска дефекта на взаимодействието. Очакваните поведения на конструкциите ZEN-4 при димеризация, свързване на микротубули (MT-свързване) и групиране са посочени (+ или –) въз основа на предишни резултати [13,34], с изключение на свързването на микротубулите на Z555ΔN (*), което се основава на резултатите, описани по-долу. CC1, CC2: навита намотка, прогнозирана с висока и ниска склонност, съответно C1: C1 домейн RhoGAP: Rho-семейство GTPase-активиращ протеин домен Кинезин: кинезин моторен домен ARFB: ARF6-свързващ домен [9,10], BIO: 20 aa биотинилиране етикет. (B-E) Протеиновите препарати, използвани в това проучване, се провеждат върху SDS-PAGE гелове и се визуализират с оцветяване на Coomassie. Имайте предвид, че версията на Z601, използвана в Z601/C120, при която липсва етикет за биотинилиране, показа малко по-голяма мобилност от тези, използвани самостоятелно или в комплекс с C40G.

Въпреки че MKLP1, кинезин-6 [20], има кинезинов моторен домен в своя N-края, той се различава от другите N-терминални кинезини (N-кинезини). В кинезините-1, -2, -3, -4, -5 и -7, каталитичната сърцевина, която съдържа ATP-свързващ джоб и повърхност, свързваща микротубулите, е свързана към навитата намотка чрез къса запазена последователност мотив от около 15 аа, т. нар. "връзка на врата" [21–23]. Шийният линкер се свързва към каталитичната сърцевина по начин, двупосочно свързан със състоянията на свързване на нуклеотиди и микротубули на каталитичното ядро. По този начин той играе решаваща роля в генерирането на сила от отделните двигателни домейни и в механохимичната координация между двете глави в ходещите кинезинови димери. Интересното е, че MKLP1 няма разпознаваем линкер за врата. Вместо това, каталитичната сърцевина на MKLP1 е свързана към навитата намотка чрез по-дълга последователност на "врата" от 60–70 aa, която съдържа дисперсна спирала / пролинови остатъци („MKLP1“ на S1 Fig) [3]. Важно е, че тази област на врата на MKLP1 съдържа мястото на свързване на CYK4. Поради тези необичайни механистични характеристики, молекулярната структура на хетеротетрамерния централен спиндлинен комплекс на CYK4 и MKLP1 е от голям интерес. Въпреки че неотдавнашно проучване, използващо спектроскопия на електронен парамагнитен резонанс, съобщава за промяна в подвижността на остатъците от шийката ZEN-4 при свързване на CYK-4 [24], остава неясно как това влияе върху конфигурацията на двата моторни домена и как това модулира свързването на микротубулите чрез комплекса.

Тук направихме директна визуализация на динамичната структура на централния шпиндлин чрез атомно-силова микроскопия. Нашите данни показват, че свързването на CYK4 с домена на шията на димера MKLP1 ремоделира конфигурацията между двата моторни домена. Освен това, използвайки in vitro функционални анализи, ние демонстрираме, че тази реконфигурация оптимизира комплекса на централния шпиндлин за образуване и натрупване в антипаралелните микротубулни снопове, които са от решаващо значение за цитокинезата.


2 РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ

Тъй като MetQ има висок афинитет към l-метионин, подготовката на апо-MetQ изисква цикли на разгъване и повторно нагъване за отстраняване на свързания лиганд. 11 Като алтернативен подход, мутация на Asn229 към Ala (N229A) в свързващия джоб на Е. coli Установено е, че MetQ значително намалява афинитета към метионина, като по този начин значително улеснява приготвянето на свободната от субстрат форма на MetQ. Въпреки обширните усилия и с двата подхода, не успяхме да кристализираме формата без субстрат Е. coli MetQ. Докато изследвахме структурно характеризирани MetQs от RCSB Protein Data Bank, ние успяхме да подготвим и кристализираме форма без субстрат на н. менингитиди MetQ (PDB 3IR1 14), съдържащ мутацията Asn към Ala при остатък 238 (N238A, съответстващ на N229A от Е. coli MetQ), за да наруши свързването на субстрата. Тъй като този аспарагинов остатък взаимодейства както с α-амино, така и с α-карбоксилови групи на l-метионин, се очаква мутацията към аланин значително да наруши свързването на лиганда. Наистина, изследванията с изотермична титруваща калориметрия (ITC) на свързване на лиганд с дивия тип и формите на N238A на н. менингитиди MetQ определя количествено въздействието на тази мутация върху свързването на l-метионин, с константа на дисоциация (Кд) променяйки се с коефициент над 10 5 , от 0,2 nM до 78 μM, свързването на d-метионина също се нарушава, но в по-малка степен, тъй като Кд променя от 3,5 до 240 μM (Фигура 1 и Таблица 1).

Протеини Лиганди Кд (μM) ΔХ (kJ mol −1 ) Некомпетентна фракция а Некомпетентна фракция е фракцията на MetQ, която очевидно не е в състояние да се свърже с титрант.
Див тип l-метионин 0,00020 [0,00017, 0,00034] b б Около 68,3% доверителни интервали, определени чрез проекция на повърхността на грешката 18, са показани в квадратни скоби.
−83 [−84, −81] 0,06 [0,049–0,067] b б Около 68,3% доверителни интервали, определени чрез проекция на повърхността на грешката 18, са показани в квадратни скоби.
Див тип d-метионин 3.5 [2.5, 4.6] −55 [−57, −53] 0,06 [0,049–0,067] b б Около 68,3% доверителни интервали, определени чрез проекция на повърхността на грешката 18, са показани в квадратни скоби.
N238A л-метионин 78 [69, 89] −42 [−50, −37] 0,04 [0, 0,067] b б Около 68,3% доверителни интервали, определени чрез проекция на повърхността на грешката 18, са показани в квадратни скоби.
N238A d-метионин 240 [190, 310] −31 [−34, −29] 0,31 [0,28–0,34] b б Около 68,3% доверителни интервали, определени чрез проекция на повърхността на грешката 18, са показани в квадратни скоби.
  • Съкращение: ITC, изотермична титруваща калориметрия.
  • а Некомпетентна фракция е фракцията на MetQ, която очевидно не е в състояние да се свърже с титрант.
  • б Около 68,3% доверителни интервали, определени чрез проекция на повърхността на грешката 18, са показани в квадратни скоби.

Кристалната структура на N238A MetQ без субстрат се определя при разделителна способност 1,56 å (Фигура 2а, PDB 6CVA) и разкрива отворена конформация с достъпна субстратна кухина. Суперпозицията на един домен на свързания с l-метионин MetQ (PDB: 3IR1) върху съответния домен на свободен от субстрат N238A MetQ разкрива 42° шарнирно завъртане, което разделя двата SBP домена и отваря кухината, свързваща субстрата (Фигура 2б). Това движение на шарнира „капан за муха на Венера“ контрастира с това, наблюдавано за връзката между лигандиран MetQ и свободен от субстрат MetQ в комплекса MetNIQ, които са свързани с 24° усукване около ос, перпендикулярна на интерфейса между двата лоба. 7 Средно квадратичното отклонение (rmsd) в Cα позиции между свободния от субстрат N238A и l-метионин-свързаната форма на н. менингитидис MetQ е 3,7 å, докато съответната rmsd между двете свободни от субстрат форми на MetQ (N238A и конформацията на MetQ в комплекс с MetNI, PDB 6CVL) е 4,4 å.

MetQ може да се свърже с други производни на метионин, включително d-метионин, но приготвянето на тези форми е било сложно поради високия афинитет към l-метионин. Например, предишно усилие за кристализиране на d-метионин-свързан MetQ беше направено от Yang et al 14 чрез отглеждане на метионинов ауксотроф Е. coli Щам B384 в среда, съдържаща 50 mg L-1 d-метионин. Поради наличието на аминокиселинни рацемази в Е. coli, обаче, те са получили структурата, свързана с l-метионин. 14 Следователно, за кристализиране на свързания d-метионин н. менингитиди MetQ, ние разработихме алтернативен подход чрез разгъване/прегъване на MetQ по време на пречистването на MetQ, за да премахнем ендогенно свързания l-метионин. Проба от разгънат/повторно нагънат MetQ след това се смесва с 10 mM d-метионин преди кристализацията. Кристалната структура на свързания с d-метионин MetQ беше решена при разделителна способност 1,68 å с ясна плътност на d-метионин в свързващата кухина (Таблица 2, PDB 6DZX). Шест молекули присъстват в асиметричната единица на d-метионин-свързания MetQ кристал. Като контрола, ние също така определихме структурата на l-метиониновата връзка н. менингитиди MetQ кристализира при подобни условия (Таблица 2, PDB 6OJA). Суперпозицията на l- и d-метионин-свързаните MetQ структури разкрива тяхната подобна конформация, със rmsd ∼0.1 å (Фигура 3а). Докато тези структури са подобни на предварително определената структура 3IR1, 14 rmsd ∼0.4 å, пространствените групи и опаковъчните взаимодействия са различни в тези две изследвания.

Не е изненадващо, че l- и d-метионинът се свързват към едно и също място, взаимодействайки със същия набор от запазени остатъци. Това наблюдение е последователно при всичките шест молекули MetQ, присъстващи в асиметричната единица. α-амино и α-карбоксилните групи както на l-, така и на d-метионина взаимодействат с остатъци R156, N213 и N238, разположени в единия домен на MetQ, докато от другия дял, остатъците Y81, F98, H100 и Y103 се опаковат около групата на метионин тиоетер (Фигура 3b). Тези свързващи остатъци са силно запазени сред различните бактериални MetQ хомолози. 11-14 Водородните връзки между страничната верига N238 и метиониновите α-амино и α-карбоксилни групи изглежда допринасят значително за афинитета на свързване, тъй като мутацията на този остатък към аланин отслабва свързването на l-метионин с над 10 5 . Въпреки свързването към едно и също място на MetQ, подробните взаимодействия за d- и l-метионина се различават, както е отразено в ∼10 4-кратната разлика в Кд стойности. Произходът на тази разлика в афинитета на свързване е труден за идентифициране, тъй като мрежата за водородна връзка, включваща α-амино и α-карбоксилните групи, е до голяма степен непроменена между двете структури, включително позиционирането на водните молекули (Фигура 3в). Кратки контакти с метиониновата CB група се наблюдават и в двете структури, като се наблюдават ∼3.3 å разстояния до Y98 CO в l-метиониновата структура и до Y81 OH групите в структурата на d-метионин. Страничните вериги на l- и d-метионина приемат различни ротамерни конформации за N-Cα-Cβ-Cγ Cα-Cβ-Cγ-Sδ и Cβ-Cγ-Sδ-Cε ъгли на усукване, които са приблизително -175°, -175 ° и −70° за l-метионин и +170°, −80° и −60° за d-метионин, последните стойности съответстват съответно на −170°, +80° и +60° за l- метионин. Следователно, докато l- и d-метионинът проявяват различни “ttm” и “tpp” ротамери, тези ротамери се намират в сравнимо изобилие в протеини (∼6% всеки 19), което предполага, че конформацията на ъгъла на усукване на страничната верига не допринася значително за разликите в афинитета на свързване (за справка, най-често срещаният метионинов ротамер е „ммм“ с 20% честота). Следователно, докато има разлики в детайлите на свързващите взаимодействия между l- и d-метионин към NmMetQ, качествената оценка не идентифицира никаква очевидна характеристика, която доминира в разликите в афинитетите на свързване за тези два лиганда.

По-високият афинитет на АТФ-свързания MetNI към MetQ без лиганд не е изненадващ, като се има предвид високият афинитет на MetQ към l-метионин (те съвместно пречистват) и необходимостта от дисоцииране на лиганда от MetQ за осъществяване на транспорт.

До момента за MetQ са характеризирани три различни конформационни състояния: една лигандирана и две безлигандни форми. Резултатите от скорошно изследване на FRET с една молекула, илюстриращо конформационното богатство на SBP и ролята на конформационната динамика в субстратния транспорт, 20 предполагат, че могат да бъдат идентифицирани допълнителни конформации на MetQ, може би за по-големи производни на метионин с модифицирани амино или карбоксилни групи, 1 -4 или в комплекси с различни състояния на транспортера MetNI. Това проучване осигурява основа за справяне с свързването между конформацията на MetQ, афинитетите на MetQ към MetNI и метионинови производни, което е в основата на спецификата на транспорта на лиганд от метиониновия транспортер. Важна следваща стъпка е да се определи кинетиката на тези взаимодействия и дешифриране как хидролизата на MgATP се свързва с транслокацията на лиганда.


Признания

Благодарим на S. R. Adams и J. Babendure за коментарите им върху ръкописа. Тази работа беше подкрепена от грант от Националния институт по здравеопазване на R.Y.T. и постдокторска стипендия за A.Y.T, безвъзмездна помощ от Алианса за клетъчна сигнализация (за J.Z. и R.Y.T.) и Медицинския институт Хауърд Хюз. ДЖЕЙ ЗИ. е подкрепен отчасти от постдокторантска стипендия от La Jolla Interfaces in Science и Burroughs Wellcome Fund и R.E.C. е подкрепен отчасти от постдокторантска стипендия от Канадските институти за здравни изследвания.


Фиг. 3

(а) Възбуждане и (б) емисионни стационарни анизотропии на Cerulean. Високата стойност на емисионната анизотропия, > 0,3, предполага ограничена гъвкавост на флуорофора в протеиновата структура. Бързото намаляване на анизотропията на възбуждане е в съответствие с FRET между ароматните аминокиселини и флуоресцентния протеинов хромофор.


Глава 6 - Генетично кодирани сонди за измерване на вътреклетъчен калций

Малките, флуоресцентни, чувствителни за калций молекули са били изключително полезни при картографирането на вътреклетъчните калциеви сигнали във времето и пространството, както свидетелстват главите в този том. Въпреки широкото им приемане и полезност, те страдат от някои недостатъци. Желателни са генетично кодирани калциеви сензори, които могат да бъдат експресирани вътре в клетките чрез трансфекция или трансгенеза. Последните 10 години бяха белязани от бърза еволюция в лабораторията на генетично кодирани калциеви сензори както в преносен, така и в буквален смисъл, което води до 11 различни конфигурации на флуоресцентни протеини и съпътстващите им калциеви сензорни модули. Тук логиката на дизайна и производителността на тази изобилна колекция от сензори и техните инвитро и in vivo са описани употребата и производителността. Генетично кодираните калциеви сензори се оказаха ценни при измерването на концентрацията на калций в клетъчните органели, в по-голямата си част в единични клетки инвитро. Техният успех като количествени калциеви сензори в тъканите инвитро и in vivo е квалифициран, но те се оказаха ценни при изобразяването на модела на калциевите сигнали в тъканите на цели животни. Някои клони на еволюционното дърво на калциевия сензор продължават да се развиват бързо и постоянният напредък в оптимизирането на параметрите на сензора води до сигурната надежда, че тези недостатъци в крайна сметка ще бъдат преодолени чрез по-нататъшно генно инженерство.


Резюме

Деубиквитиниращите ензими (DUBs) са протеази, които изпълняват решаваща роля в системата на убиквитин (Ub), чрез деконюгиране на Ub от неговите цели и разглобяване на полиUb вериги. Специфичността на DUB към една от връзките на polyUb веригата до голяма степен определя крайната сигнална функция. Представяме нов набор от диубиквитинови FRET сонди, включващи всичките седем изопептидни връзки, за абсолютното количествено определяне на специфичността на разцепването на веригата на DUBs посредством кинетика на Michaelis–Menten. Всяка сонда е снабдена с FRET двойка, състояща се от Родамин110 и тетраметилродамин, за да позволи напълно синтетичното приготвяне на сондите от SPPS и NCL. Нашата синтетична стратегия включва въвеждането на н,N′𠄋oc‐защитен 5‐карбоксиродамин като удобен градивен елемент в пептидната химия. Ние демонстрираме стойността на нашите сонди чрез количествено определяне на спецификите на връзката на панел от девет DUB по начин с висока‐производителна способност.

Ubiquitin (Ub), протеин от 76 аминокиселини, е пост‐транслационен модификатор, който е от решаващо значение за широк спектър от клетъчни процеси, включително разграждане на протеини, трафик и сигнализиране.1 Ub обикновено се свързва чрез своя C‐терминален карбоксилат към страничен амин на веригата на лизинов остатък в целевия протеин, като по този начин образува изопептидна връзка. Целевите протеини често се модифицират с polyUb верига, в която множество Ub модули са свързани последователно в N  края (линеен polyUb) или някой от седемте вътрешни лизинови остатъка (изопептид‐ свързан polyUb: K6, K11, K27 , K48 и K63). Типът на полиУб веригата до голяма степен определя нейната сигнална функция.1

Убиквитинирането се медиира от съгласуваното действие на три ензима, Е1 (активиращ), Е2 (конюгиращ) и Е3 (лигаза), чиято конкретна комбинация осигурява специфичност за протеиновата цел или топологията на полиUb веригата. Отстраняването на Ub от неговите цели и разглобяването на полиUb вериги се катализират от деубиквитиниращи ензими (DUBs). Бяха идентифицирани около 100 човешки DUBs2, някои от които показват специфичност на Ub връзката. Действието на DUB може да спаси протеините от протеазомно разграждане и да промени сигналните функции на Ub чрез ремоделиране на веригата по специфичен за връзката начин.1 Синтезът на диубиквитин (diUb) направи възможно изследването на обработката от DUBs.3 За да се определи специфичността, DUB може да се инкубира или с нативна diUb молекула4, или със сонда, базирана на diUb активност𠄅 на дадена връзка. Въпреки това настоящите методи не позволяват бързо и абсолютно количествено определяне на специфичността на DUB връзката и освен това не могат да разделят тази специфичност на афинитет на свързване и скорост на каталитичен оборот (К м и к котка, съответно в кинетика на Michaelis–Menten).

Прилагането на FRET двойки се оказа полезно при изследването на активността на DUB, конформацията на Ub веригата и Ub‐ взаимодействащите протеини.6 За да изследваме специфичността на разцепването на веригата във всички изопептидни връзки, ние разработихме пълен химичен синтез на всичките седем изопептида‐свързани diUb FRET двойки. Тези двойки носят нова двойка багрила‐, подходяща за FRET и съвместима с твърдофазов пептиден синтез (SPPS). Ние решихме К м и к котка стойности на специфичните за връзката DUB, които се използват в анализа на рестрикцията на Ub веригата7, за да се получи представа за тяхното каталитично действие.

В анализа, базиран на FRET‐ (Фигура  1 ) реагентите се състоят от два Ub модула, единият оборудван с донорен флуорофор, а другият с акцептор, те са специфично свързани чрез естествена изопептидна връзка към всеки от седемте лизинови остатъка. Разсъждавахме, че най-добрата позиция за закрепване на флуорофор ще бъде N крайните точки на двата Ub модула, тъй като разстоянието между N крайните точки варира от 30 до 50 Å, въз основа на наличните кристалографски данни (Таблица&#Sx02005 в Supporting Информация), идеално разстояние за FRET. Тъй като флуорофорите трябва да са съвместими с всички синтетични стъпки (вижте по-долу), ние разработихме нова двойка FRET, като използваме 5�rboxyrhodamine110 (Rho) като донор и 5�rboxytetramethylrhodamine (TAMRA) като акцептор. Флуоресцеинът, по-често използвания FRET донор, първоначално беше изпробван, но се оказа несъвместим със стъпката на десулфуризация в крайния етап на синтез (виж по-долу) и следователно беше заменен с Rho. При добавяне на DUB, двойката diUb FRET се разцепва, което води до загуба на FRET сигнала и следователно до увеличаване на донорното излъчване.

Принцип на FRET‐-базиран анализ на diUb разцепване. При разцепване на двойката diUb FRET от DUB, FRET сигналът се губи.

Основен проблем при използването на Rho (но също и TAMRA) в SPPS (Схема  1 𠂚) е, че когато Rho е прикрепен към амин в глобално защитен пептид, 1  Rho карбоксилат на Rho. е в отворена конформация и може да реагира при по-нататъшно удължаване на пептидната верига (Схема  1 𠂚, 12). В допълнение, свързването на Rho обикновено е трудно поради лошата разтворимост и присъщата реактивност на анилиновите части. Затова се подготвихме N,N′𠄋oc‐защитен Rho. Когато тази молекула е свързана с пептид, двойната Boc защита заключва 1‐карбоксилата в затворена лактонова форма, като по този начин го прави нереактивен (Схема  1 𠂚, 34). Модифицирахме метода, докладван от Grimm и Lavis8, за да се подготвим н,N′𠄋oc‐защитен Rho 10 (Схема  1 ). 5‐Карбоксифлуоресцеин (5) беше преобразуван в четири стъпки в дитрифлат 8. Buchwald–Съединител Hartwig с BocNH2 доведе до образуването на н,N′𠄋oc‐защитен Rho (9). Използването на защита от етилов естер на 5‐карбоксилата позволява селективно освобождаване на 5‐карбоксилата, без да се засягат Boc групите, което води до 10. За разлика от незащитения Rho, 10 е много разтворим в органични разтворители, може лесно да се свърже при стандартни условия на пептидно свързване и може да бъде приготвен в мащаб от няколко грама.

Седемте двойки diUb FRET 17𠂚ж са конструирани чрез естествено химическо лигиране (NCL) между Rho‐Ub‐тиоестер 14 и TAMRA‐Ub, съдържащи градивен блок γ‐thioLys3, 9 16 (Схема  2 ). Отделните Ub модули са синтезирани чрез линеен SPPS върху хипер‐киселина‐лабилна тритилова смола.3 DiBoc‐защитен Rho (10) беше свързан с Уб1� (11) върху смола, за да се получи 12, който впоследствие беше отцепен от смолата при меки киселинни условия, без да се засяга глобалната схема за защита. Метил𠄃‐(глицилтио)‐пропионат се свързва с освободения C‐терминален карбоксилат, за да се получи 13. Глобалното премахване на защитата при силни киселинни условия, последвано от катионен обмен и пречистване с RP‐HPLC, дава Rho‐Ub‐тиоестер 14. Трябва да се отбележи, че Boc групите на Rho се отстраняват едновременно по време на глобалното премахване на защитата, като по този начин се възстановяват неговите флуоресцентни свойства. TAMRA‐Ub модули, съдържащи γ‐thioLys на всяка от съответните позиции на лизин (16𠂚ж) бяха получени чрез свързване на 5‐карбокси изомера на TAMRA към Ub1� полипептиди 15𠂚ж, последвано от глобално премахване на защитата и пречистване (Фигура S1 в поддържащата информация). Метионин𠄁 беше заменен с изостер норлевцин, за да се предотврати окисляването на тиоетерната част. NCL реакции между 14 и 16𠂚ж, последвано от десулфуризация при радикални условия,10 пречистване чрез RP‐HPLC и гел филтрация дават последните седем двойки diUb FRET 17𠂚ж с добър добив и чистота.

Чистотата на 17𠂚ж бяха потвърдени чрез LCMS анализ (Фигура  2 𠂚, B и поддържаща информация) и гел анализ (Фигура  2 𠂜). Upon excitation at 466 nm, the emission spectra of the diUb FRET pairs and Rho‐Ub and TAMRA‐Ub revealed that all seven molecules show a clear FRET signal (Figure  2 𠂝). We performed fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to determine FRET efficiencies of all the FRET pairs (Figure  2 𠂞, Table S3) these were found to be 0.45𠄰.60, depending on the linkage, thus demonstrating efficient FRET in all these molecules.

Characterization of diUb FRET pairs 17𠂚ж. A)𠁚nalytical HPLC and B) MS of Lys6‐linked diUb FRET pair 17𠂚. C) SDS‐PAGE analysis. D)𠁞mission spectra recorded at λ напр=466 nm. E)𠁟RET efficiencies (Е) determined by FLIM.

DUB‐mediated cleavage of our new diUb FRET pairs was first assessed by incubation with USP7 and OTUD2, two well‐studied DUBs from the two largest DUB families and for which cleavage of unlabeled diUbs has been reported. Reactions were analyzed by SDS‐PAGE (Figures S2 and S3) which showed that the diUb selectivity of both DUBs was in good agreement with reported data.4a,4b We then incubated OTUD2 with Lys11‐ and Lys27‐linked diUb FRET pairs (17𠂛 и 17𠂜, respectively) and the corresponding unlabeled diUbs. We also included a 1:1 mixture of the FRET pair and the unlabeled diUb for both linkages. SDS‐PAGE analysis (Figures  3 𠂚, S4 and S5) showed that both the FRET pair and the unlabeled diUb substrates were equally processed, thus we concluded that the attached fluorophores do not affect DUB activity.

A) SDS‐PAGE analysis of Lys11‐linked diUb cleavage. OTUD2 was incubated with unlabeled diUb, FRET pair 17𠂛, or a 1:1 mixture samples were taken after 10, 30, 60, and 180 min. B) Michaelis–Menten kinetics of TRABID for Lys29‐, Lys33‐ and Lys63‐linked diUb, as determined by the FRET assay.

We next applied our FRET reagents for the quantification of diUb linkage‐specificity for nine DUBs derived from three different DUB families each was shown to display a distinct specificity (Table  1 ).4b We incubated the DUBs with all diUb FRET pairs at a fixed concentration (0.5 μ m, to keep initial fluorescence constant for all samples) with an increasing concentration of the unlabeled diUb (0� μ m ). The enzyme concentration was chosen such that the reaction proceeded linearly for at least 20 min (Supporting Information). The total amount of processed diUb was then determined by monitoring the increase in donor fluorescence over time from this the rates of initial velocity were calculated and fitted to the Michaelis–Menten equation (Figure  3 𠂛 and Supporting Information), from which К м и, к котка were determined.

Маса 1

Kinetic characterization of DUBs that are used in Ub chain restriction analysis7 for the diUb FRET pairs 17𠂚ж. [a]

DUBLinkage К м [μ m ] к котка [s 𢄡 ] к котка/К м [ m 𢄡  s 𢄡 ]
AMSHLys63 45.40.002759
AMSH* [b] Lys632.40.1770�
CezanneLys1119.41.578�
OTUB1Lys48n.d.
OTUB1* [b] Lys48 38.60.6617�
OTUD1Lys63n.d.4020
OTUD3Lys6n.d.
Lys11 52.40.0085162
Lys63 57.90.0061105
TRABIDLys29 40.10.0531317
Lys3319.60.0281431
Lys63 54.00.034627
OTUD2Lys11 87.94.450�
Lys27n.d.
Lys29n.d.
vOTULys63.60.87242�
Lys113.40.2263�
Lys488.41.0119�
Lys631.40.09166�
USP21Lys62.10.1260�
Lys111.40.08762�
Lys332.10.1360�
Lys481.70.06739�
Lys632.70.1660�

[a] Values in italics were obtained by extrapolation beyond the highest substrate concentration. [b]�tivated versions of AMSH and OTUB1 were created by fusing them to their activators (STAM and UBE2D2, respectively).11

Table  1 shows the data for all combinations of DUB and diUb substrate for which activity could be measured. Overall, the individual diUb linkage types cleaved by each DUB were consistent with published qualitative data.4 As expected from earlier findings, the unspecific DUB USP21 showed similar activity towards most linkages.4a The virus�rived DUB vOTU, which is also considered to be unspecific, showed some interesting results: the catalytic efficiency (к котка/К м ) for Lys6 was two times higher than for Lys48, and four times higher than for Lys11 and Lys63 diUbs this can largely be attributed to differences in к котка отколкото К м . Another interesting result was for AMSH. In agreement with earlier findings, this DUB had absolute specificity for Lys63 diUb,4c although the overall efficiency was rather low. Remarkably, the recently reported fusion of AMSH with its natural activator STAM211 resulted in a more than 1000𠄏old increase in catalytic efficiency, which can be attributed to increases in both affinity and catalytic turnover. Taken together, these data show that our quantitative assessment of the DUB linkage specificity is in accordance with reported data and that new insights can be obtained from the kinetic parameters.

In summary, the set of all seven isopeptide‐linked diUb FRET pairs allows absolute quantification of DUB linkage specificity. Our synthetic strategy, which includes a convenient н,N′𠄋oc‐protected Rho building block, allows efficient preparation of these reagents in large quantities. The assay requires low amounts of material, can easily be automated, and can be used in high‐throughput small‐molecule screening or for the assessment of (di)Ub binding domains.6c Overall, we believe that our diUb FRET probes will be of great value in ongoing efforts to crack the ubiquitin code and that the FRET pair presented here will facilitate FRET‐pair synthesis in general.


Резюме на автора

There is abundant evidence that insufficient energy, or energy failure, contributes to the pathophysiology of many inherited and degenerative diseases, cancer, and aging. However, we understand little about how cellular energy levels are regulated. To begin to address this gap, we developed a screening approach that uses a fluorescent biosensor to measure relative levels of ATP in individual cells and used this approach to identify those genes that are most essential to maintaining energy levels. We screened approximately 2,200 genes and found that mitochondrial ribosomal proteins are particularly critical in maintaining energy levels and enabling cell growth. We also used this approach to identify genetic targets that could be amenable to an energy-based therapy via supplementation with the mitochondrial cofactor coenzyme Q10 (CoQ10). These included CoQ10 biosynthetic genes associated with human disease as well as a subset of genes not previously linked to CoQ10 biosynthesis. Our screening paradigm thus reveals mechanisms by which cellular energy levels are controlled. It can also be used to identify genetic defects that will be responsive to energy-based therapies. Application of this approach may additionally enable powerful screens for other key metabolites to further advance a genome-scale understanding of the regulation of metabolism.

Цитат: Mendelsohn BA, Bennett NK, Darch MA, Yu K, Nguyen MK, Pucciarelli D, et al. (2018) A high-throughput screen of real-time ATP levels in individual cells reveals mechanisms of energy failure. PLoS Biol 16(8): e2004624. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2004624

Академичен редактор: Rong Tian, University of Washington, United States of America

получено: October 30, 2017 Прието: July 26, 2018 Публикувано: August 27, 2018

Авторско право: © 2018 Mendelsohn et al. Това е статия с отворен достъп, разпространявана при условията на лиценза Creative Commons Attribution License, който позволява неограничено използване, разпространение и възпроизвеждане във всяка среда, при условие че оригиналният автор и източник са посочени.

Наличност на данни: Всички релевантни данни са в документа и неговите файлове с поддържаща информация. Specifically, S1 Table contains screen data for all genes in all conditions.

Финансиране: Joan and David Traitel Family Trust. KN, BAM, NKB, MAD, KY, MKN, and MN. Финансьорът не е имал роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. Betty Brown’s Family. KN, BAM, NKB, MAD, KY, MKN, and MN. Финансьорът не е имал роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. Hagar Family Foundation. JLN and DP. Финансьорът не е имал роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. Burroughs Wellcome Fund Medical Scientist Career Award. KN, BAM, MAD, and KY. Финансьорът не е имал роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. Pediatric Scientist Development Program (grant number K12-HD000850). BAM. Финансьорът не е имал роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. NIH (grant number R01 NS091902, 5P30 NS069496, U54CA196519, R01 DA036858, U01 CA168370, DP2 GM119139, RR018928, S10-RR028962, K99/R00 CA204602). R01 NS091902: KN, 5P30 NS069496: KN, BAM, NKB, MAD, KY, MKN, and MN, U54CA196519: JLN, R01 DA036858: LG, MAH, and MK, U01 CA168370: LG, MAH, and MK, DP2 GM119139: MK, S10-RR028962: Gladstone flow cytometry core: LG, K99/R00 CA204602. Финансьорът не е имал роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. St. Baldrick’s Scholar Award. JLN and DP. Финансьорът не е имал роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. Howard Hughes Medical Institute. LG, MH, and MK. Финансьорът не е имал роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. CFAR grant (grant number P30-AI-027763). Gladstone flow cytometry core. Финансьорът не е имал роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. James B. Pendelton Charitable Trust. Gladstone flow cytometry core. Финансьорът не е имал роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкурентни интереси: Авторите декларират, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Съкращения: 2DG, 2-deoxyglucose ATPbasal, ATP levels under basal conditions ATPgly, ATP levels under glycolytic conditions ATPresp, ATP levels under respiratory conditons CFP, cyan fluorescent protein CoQ10, coenzyme Q10 COS, CV-1 (simian) in origin, and carrying the SV40 genetic material CRISPRi, clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference dCas9, dead CRISPR-associated protein 9 ECAR, extracellular acidification rate FACS, fluorescence-activated cell sorting FBS, fetal bovine serum FCCP, carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone FRET, fluorescence resonance energy transfer GROWTHбазална, growth under basal conditions GROWTHglyc, growth under glycolytic conditions GROWTHresp, growth under respiratory conditions HGNC, HUGO Gene Nomenclature Committee HPLC, high-performance liquid chromatography KRAB, Kruppel-associated box MELAS, mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes MICOS, mitochondrial contact site and cristae organizing system mVenus, monomeric Venus NDUFS4, NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit S4 OCR, oxygen consumption rate PVDF, polyvinylidene fluoride qRT-PCR, quantitative real-time reverse transcription PCR RNAi, RNA interference ROS, reactive oxygen species sgRNA, single guide RNA shRNA, short hairpin RNA TCA, tricarboxylic acid Tom20, translocase of outer membrane 20 kDa subunit


Информация за автора

Matthew Y. Tang and Marta Vranas: These authors contributed equally to this work

Принадлежности

Department of Neurology and Neurosurgery, McGill Parkinson Program, Neurodegenerative Diseases Group, Montreal Neurological Institute, McGill University, Montréal, Québec, Canada H3A 2B4

Matthew Y. Tang, Andrea I. Krahn, Shayal Pundlik & Edward A. Fon

Department of Pharmacology and Therapeutics, Groupe de Recherche Axé sur la Structure des Protéines, McGill University, Montréal, Québec, Canada H3G 1Y6


Гледай видеото: Метионин и триптофан аминокислоты вызывают старение (Август 2022).