Информация

Концентрация на специфичен промотор в клетка?

Концентрация на специфичен промотор в клетка?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Искам да симулирам активиране на транскрипция от даден транскрипционен фактор (TF) с известна кинетика. Скоростта на свързване $k_{on}$ е дадена в $mu M^{-1} s^{-1} $, описвайки бимолекулен реакционен механизъм (реакционна кинетика от втори ред). Каква е обаче концентрацията на специфичен промотор в клетката?


В диплоиден организъм има две копия на ДНК, което означава две копия или "молекули" на промотора в цялата клетка. Обемът на типична еукариотна клетка (HeLa) би бил 2,25 × 10-12 литра (Zhao et al. 2007, BioNumbers).

$$ ext{Концентрация }(M)=frac{ ext{Молекули на клетка}}{ ext{Avogadro No.} imes ext{Обем на клетката }(l)}$$

Това достига до около 1,4758 × 10-12 M за 2 молекули промотор. Съответно можете да изчислите за хаплоидна клетка, множество алели или прокариотна клетка.

Можете също да приемете модел с 2 отделения с ядро ​​и цитоплазма като две различни отделения. В този случай ДНК ще бъде локализирана в ядрото и следователно ефективната й концентрация ще бъде по-висока в ядрото. Можете да потърсите ядрен обем в BioNumbers и да го включите в горната формула, за да получите ефективната концентрация.


Zhao, L., et al. "Вътреклетъчен водно-специфичен MR на клетки, прилепнали към микросфери: живот на вътреклетъчната обменна вода на HeLa клетки." ЯМР в биомедицината 21.2 (2008): 159-164.


Естрадиол-индуцируем промотор позволява бърз, постепенен контрол на генната експресия в дрожди на делене

На делещите се дрожди Schizosaccharomyces pombe липсва разнообразен инструментариум от индуцируеми промотори за експериментална манипулация. Наличните индуцируеми промотори страдат от бавна индукционна кинетика, ограничен контрол на нивата на експресия и/или изискване за определена растежна среда. По-специално, нито една индуцируема от S. pombe промоторна система не показва линейна доза-отговор, което би позволило експресията да бъде настроена на специфични нива. Ние адаптирахме бърза, ортогонална промоторна система с голям динамичен диапазон и линеен отговор на дозата, базирана на β-естрадиол-регулирана функция на човешкия естрогенен рецептор, за използване в S. pombe. Ние показваме, че тази промоторна система, наречена Z3 EV, се включва бързо, може да достигне максимална индукция от 20 пъти и показва линеен отговор на дозата в целия си диапазон на индукция, с малко ефекти извън целта. Ние демонстрираме полезността на тази система, като регулираме митотичния инхибитор Wee1, за да създадем щам, в който размерът на клетките се регулира от концентрацията на β-естрадиол. Тази промоторна система ще бъде от голяма полза за експериментално регулиране на генната експресия в дрожди на делене. Авторско право © 2017 John Wiley & Sons, Ltd.

Ключови думи: Schizosaccharomyces ZEV естрадиол, индуцируем от дрожди промотор pombe.

Авторско право © 2017 John Wiley & Sons, Ltd.

Фигури

Фигура 1. Z 3 EV регулира зависими от дозата...

Фигура 1. Z 3 EV регулира дозозависимата експресия в S. pombe

(A) Схематично представяне на β-естрадиол-индуцирания...

Фигура 2. Z 3 EV регулира изразяването...

Фигура 2. Z 3 EV регулира експресията в голям динамичен диапазон

Фигура 3. Z 3 EV показва Rapid…

Фигура 3. Z 3 EV показва бърза индукционна кинетика

(А) Я 3 EVpr: кинетика на индукция на GFP иРНК. Z…

Фигура 4. Глобални ефекти на Z 3…

Фигура 4. Глобални ефекти на Z 3 EV активност върху клетъчния растеж и генната експресия


Концентрация на специфичен промотор в клетка? - Биология

Резюме на статията:

Промотори, използвани в генната регулация и нейните типове
Автор: Ekatpure Sachin Chandrakant

Въведение :
Потокът от генетична информация в клетката започва от ДНК, която се възпроизвежда, за да образува повече ДНК. След това информацията се „транскрибира“ в РНК и след това се „превежда“ в протеин. За цялостния процес на генна регулация има нужда от регулаторни елементи като промотори и цис-действащи елементи. Координатният ефект на тези елементи може да индуцира експресията на ген.

Определение
Генните промотори са ДНК последователности, разположени нагоре от генно кодиращите региони и съдържат множество цис-действащи елементи, които са специфични места за свързване за протеини, участващи в инициирането и регулирането на транскрипцията. В повечето транскрипционни единици промоторите са разположени до началното място на транскрипцията, но сами по себе си не се транскрибират. Промоутърите обикновено съдържат "основен промотор", което е регион, открит 󕾘 bp нагоре от мястото на иницииране на транскрипция, което съдържа кутията TATA. ТАТА кутия е мястото на свързване на фактора за иницииране на транскрипция TFIID TBP (TATA-box-Binding Protein) субединица.

Нагоре по веригата на ядрото на промоторната област са проксималните и дисталните области на промоторите. Проксималните и дисталните области на промотора съдържат различни регулаторни последователности като подобрители, заглушители, изолатори и Cis-елементи, които допринасят за фината регулация на генната експресия на транскрипционно ниво (Фигура 1).

Фигура 1: Различни регулаторни елементи и техните относителни позиции

По време на транскрипцията, ко-активаторите и транскрипционните фактори се свързват със специфични ДНК мотиви и едновременно взаимодействат с транскрипционната машина, прикрепена към основния промотор. Тази сложна връзка ДНК/протеин води до активиране, усилване или потискане на транскрипцията. По този начин регулирането на транскрипцията зависи от: Наличността и активността на транскрипционните фактори. Типът, броят, позицията и комбинацията от регулаторни елементи, присъстващи в и около промоторния регион. Регулирането на генната експресия на ниво промотор се контролира главно от цис-действащите елементи, локализирани нагоре по веригата от началното място на транскрипцията

Запазени еукариотни промоторни елементи
CAAT кутия: Консенсусна последователност, близка до -80 bp от началната точка (+1). Той играе важна роля в ефективността на промотора, като увеличава неговата сила. Изглежда, че функционира и в двете ориентации. Тази кутия се заменя в растенията с консенсусна последователност, известна като AGGA кутия.
ТАТА кутия: Последователност, която обикновено се намира около -25 bp нагоре от началната точка. TATA кутията има тенденция да бъде заобиколена от богати на GC последователности. TATA кутията свързва РНК полимераза II и серия от транскрипционни фактори
GC кутия: Последователност, богата на гуанидин (G) и цитозин (C) нуклеотиди. Обикновено се намира в множество копия в региона на промотора, обикновено в близост до TATA кутията
CAP сайт: Дали последователност за започване на транскрипция или начална точка, дефинирана като +1, в която всъщност започва процесът на транскрипция.


Консенсусни последователности

Видове промотори, използвани за регулиране на генната експресия
Има различни видове промотори, налични в молекулярната биология, изброени по-долу. Промотори с различни функции и роля в генната регулация.

Тези промотори диктуват експресията в почти всички тъкани и са до голяма степен, ако не и напълно, независими от фактори на околната среда и развитието. Тъй като тяхната експресия по принцип не е обусловена от ендогенни фактори. Конститутивните промотори обикновено са активни между видовете и дори в царствата.
Промотори на растителни патогени: CAMV 35 S и Opine промотор Промотори на моносемели: растителен убиквитин промотор (Ubi), ориз актин 1 (Акт-1) и царевица
дехидрогеназа 1 (Adh1)

Предимства на конститутивните промоутъри:
Високо ниво на производство на протеини, използвани за избор на трансгенни клетки или растения
Високо ниво на експресия на репортерни протеини или маркери, позволяващи лесно откриване и количествено определяне
Високо ниво на производство на транскрипционен фактор, който е част от регулаторна транскрипционна система.
Производство на съединения, което изисква повсеместна активност в растението и
Производство на съединения, които са необходими по време на всички етапи от развитието на растенията

Тъканно-специфични или специфични за етапа на развитие промотори:
Тъканно-специфични промотори: които действат в определени тъкани и в определени етапи на развитие на растението. Те могат да бъдат произведени от ендогенни и екзогенни фактори, така че могат да бъдат класифицирани и като индуцируеми. За растенията промоторните елементи, които се експресират или влияят върху експресията на гени в съдовата система, като фотосинтетични тъкани, грудки, корени, други вегетативни органи, семена, репродуктивни органи, могат да бъдат намерени в хетероложни системи. Тъканно специфични промотори са три вида. 1. Промоторите на корените, 2. Промоторите на плодовете, 3. Промоторите на семена.

Индуцируеми промотори:
Те се изразяват само при наличие на фактори/съединения, тъй като тяхната експресия обикновено е ограничена до определени растителни тъкани. Те също могат да се считат за тъканно-специфични Въз основа на естеството на факторите, които предизвикват тяхната експресия, те се класифицират в две групи:

Химически регулиран: Това са химическите съединения, които обикновено не се срещат естествено в растенията, които включват промоторна активност. Няколко от видовете промотори включват химерни компоненти, събрани от човешки, животински, гъбични и бактериални източници. Свързани с патогени: етилен, SA, тиамин, бензол

Стероидно регулирани: глюкокортикоидни рецептори (GR) и глюкокортикоиден отговорен елемент (GRE)

Регулиран метал: мед, цинк, злато, кобалт

Тетрациклин регулиран: антибиотична резистентност

Физически регулиран: където абиотични и външни фактори като светлина, топлина, механични наранявания предизвикват промоторна активност

Регулиране на температурата: предизвикано от топлина и студено
Регулиране на светлината: Индуциране на светлина и потискане на светлината

Синтетични промотори
Синтетичните промотори са ДНК последователности, които не се срещат в природата и които са предназначени да регулират активността на гените, контролирайки способността на гена да произвежда свой собствен уникално кодиран протеин.

Препратки:
1. Potenza, C., Aleman, L. and Sengupta-Gopalan, C. 2004. Насочване на трансгенна експресия в научни изследвания, селскостопански и екологични приложения: промотори, използвани при трансформация на растенията. In Vitro клетъчна и биол. 40, стр. 1-22.

2. Peremarti, A. et al. 2010. Промоторно разнообразие в мултигенна трансформация. Растение Mol. Биол., 73, стр. 363-378.


За автора / Допълнителна информация:
Докторант (Биотехнология на растенията), интересуващ се от генетично инженерство и изследвания на молекулярната биология

Важен отказ от отговорност: Всички статии на този уебсайт са само за обща информация и не са професионален или експертен съвет. Ние не носим никаква отговорност за коректността или автентичността на информацията, представена в тази статия, или каквато и да е загуба или нараняване в резултат на това. Ние не одобряваме тези статии, нито сме свързани с авторите на тези статии, нито сме отговорни за тяхното съдържание. Моля, вижте нашия раздел за отказ от отговорност за пълни условия.


Въведение

Липидите, със своите хидрофилни и хидрофобни свойства, осигуряват мощен инструментариум за нанотехнологиите [1]. Те могат да бъдат самостоятелно сглобени в нано-филми и други наноструктури, включително мицели, обратни мицели и липозоми [1]. Охарактеризирани са комплекси липид-протамин-ДНК (LPD). in vivo доставяне на ген с репортерни плазмидни конструкции [23]. Нашата лаборатория показа, че клетъчното насочване и клетъчно-специфичните пептиди (хоуминг пептиди), интегрирани в LPD, могат да увеличат ефективността на доставянето на гени в клетките на бозайници [45]. През 2014 г. ние демонстрирахме за първи път, че подпомогнатата от наночастици насочена доставка на специфични за очите гени значително подобрява зрението на слепи мишки in vivo [6].

Едно от ограниченията на LPD е клетъчната специфичност [7]. Въпреки това, в нашето по-ранно проучване, LPD-медиираната доставка на ген успешно възстанови визуалната функция при мишки, които нямат тази функция, тъй като доставеният ген се експресира само в един тип ретинална клетка [6]. Ако един и същ ген се експресира в множество клетъчни типове, LPD-медиираната доставка на ген може да има ефекти извън целта. Ретината се състои от седем различни вида нервни клетки. Следователно, има нужда от специфично за клетката доставяне на LPD наночастици.

За да демонстрираме значението и иновативната природа на LPD в ретината, ние първо показахме, че клетъчно-специфичните промотори позволяват на липид-базирани наночастици да доставят гени до специфични клетки на ретината in vivo. В настоящото изследване постигнахме специфичност на пигментните епителни клетки на ретината с вителиформна макулна дистрофия (VMD2), специфичност на пръчковидна клетка с миши родопсин, специфичност на конусните клетки с червен/зелен опсин и специфичност на ганглийните клетки с тимоцитни антигенни промотори (Фиг. 1).

Клетъчно-специфично доставяне на гени на ретината. Липозомен протамин/ДНК липоплекс (LPD), интегриран с пептид на сигнал за ядрена локализация (NLS) и трансактиватор на транскрипционен (TAT) пептид, е конструиран за доставяне на гени до клетките на пигментния епител на ретината (RPE), пръчковидни клетки, конусовидни клетки и ганглий клетки на ретината, използващи клетъчно-специфични промотори. Постигнахме RPE клетъчна специфичност с вителиформна макулна дистрофия (VMD2, 583 bp), специфичност на пръчковидна клетка с миши родопсин (225 bp), специфичност на конусните клетки с човешки червен/зелен опсин (2100 bp) и специфичност на ганглийните клетки с тимоцитен антиген (твоя 1.2, 6500 bp) промотори.

(Щракнете върху изображението, за да го увеличите.)


Заключителен изпит по клетъчна биология

б. аминокиселинна позиция 173 в повечето митохондриални и хлоропластни протеини.

° С. N-края на прекурсорния протеин.

а. АТФ хидролиза от шаперон протеини в цитозола.

б. АТФ хидролиза от шаперон протеини в митохондриалния матрикс.

° С. протонната движеща сила през вътрешната митохондриална мембрана.

а. общ цитозолен рецептор.

б. общ рецептор за внос и транслокационен механизъм върху пероксизомната мембрана.

° С. общ рецептор в ядрената пора, който катализира навлизането в ядрото чрез последователности, насочени към порите.

° С. основни сигнали за ядрена локализация в карго протеини.

"Пероксизомите са интересни органели с една мембрана и притежават таланта да внасят естествени протеини. Pex5 е един от протеините, който помага на протеините да се насочат към пероксизома. След това той свързва много други протеини на Pex, така че да освобождава вносния протеин и да излиза от пероксизома. Пероксизомът има голям набор от Pex протеини, които улесняват вноса и вмъкването на протеини.

а. Маслената киселина дифундира в липозомата 100 пъти по-бързо от бутандиола.

б. Двете дифундират в липозомата с еднаква скорост.

° С. Бутандиолът дифундира в липозомата 100 пъти по-бързо от бутандиола.

а. Подобно на простата дифузия, еднопортовият транспорт е неспецифичен.

б. Uniport транспортът е по-бавен, но по-специфичен от обикновената дифузия.

° С. Uniport транспортът е много по-бърз и по-специфичен от обикновената дифузия.

а. Помпи от суперсемейство ABC и P-клас

б. Помпи от суперсемейство ABC и P-клас

° С. Помпи от клас F и помпи от клас P

а. калмодулин-активираната плазмена мембрана Ca2+ ATPase.

б. Са2+ АТФаза на саркоплазмения ретикулум.

° С. вакуоларната протонна помпа F-клас.

а. По време на транспорта, мястото на свързване на лиганда се излага последователно на екзоплазмената и цитоплазмената страна на мембраната.

б. По време на транспортирането, запазен остатък от аспарт се фосфорилира.

° С. Този клас помпи транспортират само H+ йони.

б. Те се намират в мембраните на растителните вакуоли.

c Те служат за намаляване на pH в лизозома.

а. еволюция от различни и различни родителски протеини.

б. дивергентна еволюция от един вид канален протеин.

° С. ниска енергия на активиране за селективно преминаване на дехидратирания йон.

а. Той увеличава цитозолния Na+ и следователно намалява износа на Ca2+.

б. Той увеличава цитозолния К+ и следователно намалява износа на Ca2+.

° С. Той намалява цитозолния Na+ и следователно намалява износа на Ca2+.

а. повишено натрупване на Na+

б. намалено натрупване на Na+

а. свързване на транспорта на глюкоза с движението на протоните.

б. свързване на транспорта на глюкоза с движението на Na+.

° С. свързване на транспорта на глюкоза с движението на Са2+.

а. изнасяне на "излишък" на цитозолен OH- като HCO3-.

° С. запазване на електронеутралността чрез придружаване на движението на всеки Cl- йон в лумена на стомаха с K+.

а. градиент на напрежение през външната мембрана.

б. градиент на напрежение през вътрешната мембрана.

° С. рН градиент през външната мембрана.

а. F0 комплексът на АТФ синтазата.

б. F1 комплекс на АТФ синтаза.

° С. протеин на протонния канал.

а. изразяват lac репресора конститутивно.

б. блокира свързването на РНК полимеразата с промотора.

° С. експресира -галактозидаза конститутивно.

а. PhoB има киназна активност.

б. PhoB е цитозолен протеин.

° С. Фосфорилираният PhoB е неактивен транскрипционен активатор.

а. свързването на lac репресор блокира взаимодействието на РНК полимеразата с ДНК в началното място.

б. lac репресорното свързване индуцира ДНКаза, която разцепва ДНК в началното място на транскрипцията.

° С. lac репресорното свързване причинява конформационна промяна в РНК полимеразата.

б. инкубиране с 32P-белязан рибонуклеозид трифосфат

° С. излагане на клетките на белязан прекурсор на РНК

а. CTD присъства в РНК полимераза I, II и III.

б. CTD може да се фосфорилира.

° С. CTD е от решаващо значение за жизнеспособността.

а. служи като промоторна последователност за гени, транскрибирани от РНК полимераза III.

б. се намира приблизително 100 базови двойки нагоре по течението от началното място за иРНК.

° С. присъства във всички еукариотни гени.

а. TFIID, TFIIB, Pol II, TFIIH

б. PolII, TFIID, TFIIB, TFIIH

° С. TFIIB, PolII, TFIIH, TFIID

а. свързване към кутията TATA

б. развиване на ДНК дуплекса

° С. катализира синтеза на РНК

а. е ДНК елемент, който стимулира транскрипцията на еукариотни промотори.

б. се свързва с РНК полимераза и стимулира транскрипцията.

° С. действа като място на свързване на РНК полимераза.

а. участък от пет левцинови остатъка подред.

б. левцинов остатък на всяка седма позиция.

° С. левцинов остатък, комплексиран с цинков йон.

а. Хетерохроматинът оцветява по-тъмно с ДНК багрила, отколкото еухроматинът.

б. Хетерохроматинът съдържа повече силно кондензирана ДНК от еухроматина.

° С. Хетерохроматинът е свързан с неактивни гени.

а. може да образува молекулен мост между активаторите на транскрипцията и ДНК репликационните машини.

б. може да функционира за поддържане на промотор в хипоацетилирано състояние.

° С. има хистон ацетилазна активност.

а. винаги се намират в еухроматина.

б. не са разположени в нуклеозомите.

а. променлив регион, ДНК-свързващ домен, лиганд-свързващ домен

б. ацетилазен домен, ДНК-свързващ домен, лиганд-свързващ домен

° С. променлива област, ацетилазен домен, лиганд-свързващ домен

а. За започване не е необходима хидролиза на АТФ.

б. Pol III е отговорен за синтезирането на tRNAs и 5S-rRNA.

° С. Промоторните елементи на tRNA гените лежат изцяло в транскрибираната последователност.

а. За започване не е необходима хидролиза на АТФ.

б. Pol III е отговорен за синтезирането на tRNAs и 5S-rRNA.

° С. Промоторните елементи на tRNA гените лежат изцяло в транскрибираната последователност.

а. грубия ендоплазмен ретикулум

а. Na+ и OH- транспортни протеини в лизозомната мембрана.

б. H+ и Cl− транспортни протеини в плазмената мембрана.

° С. ензими, произвеждащи киселина в лизозомния лумен.

б. груб ендоплазмен ретикулум.

а. Ендоплазмен ретикулум

а. трансмисионна електронна микроскопия

б. сканираща електронна микроскопия

а. оцветени проби за светлинна микроскопия.

б. образци на покритие за метална сенчеста електронна микроскопия.

° С. оцветени проби за трансмисионна електронна микроскопия.

а. местоположение на специфични протеини.

б. концентрация на Н+ йони в специфични области на клетката.

° С. количеството РНК в клетката.

а. флуоресцентна микрокопия с пълно вътрешно отражение

б. фотоактивирана локализираща микроскопия

° С. индиректна имунофлуоресцентна микроскопия

а. ендоплазмения ретикулум

а. флуоресцентно активирана машина за сортиране на клетки.

б. антитела, прикрепени към бактериални носители и нискоскоростно центрофугиране.

а. клетка-предшественик, която поражда гамети.

б. безсмъртна имунна клетка, която не може да произвежда .

° С. самообновяваща се стволова клетка.

а. каталазно моноклонално антитяло и трансмисионна електронна микроскопия

б. платина или злато и сканираща електронна микроскопия

б. способност за диференциране.

а. съдържат много хидрофобни аминокиселинни остатъци.

б. съдържат мембранни домени.

° С. имат ковалентно прикрепени липидни или мастни киселини.

а. Голджи-зависими механизми.

б. непълно характеризирани популации от везикули.

° С. директен контакт между мембраните и до известна степен малки, разтворими протеини за пренос на липиди.

тип II в ER, който закотвя веригата в мембраната и принуждава N-края да се обръща извънклетъчно, а C да отиде в цитозола

между две клетки са клетъчни връзки. се нуждаят от тесни връзки.

трансепителен транспорт на глюкоза = глюкоза, взета в клетката от червата чрез глюкозо/2 Na+ симпортер

глюкозата дифундира от клетката към кръвта чрез GLUT2 пасивен транспорт.

НО! Na+ трябва да изгасне. така че го прави чрез Na+/K+ АТФаза. (K+ може да напусне през канал за покой)

H20 се разделя на H+ и OH-, за да дари секретирания H+. така че OH- се натрупва. който се изпраща в кръвта чрез HCO3 антипортера с Cl- (поддържа заряда на клетките).

отстранена е фосфатната глава. добавен холин върху цитоплазменото лице.

GPCR се свързва с Gai протеин - инхибира неговия ефекторен протеин - чрез действието на GBy субединицата, която е субединицата, отговорна за взаимодействието с ефекторния протеин - K+ канал.

се случва следното:
-GPCR се свързва с ацетилхолин,
=G протеин за взаимодействие с него.
GDP се отделя от подединицата Gai и се заменя с GTP-- това позволява на подединицата Gai да се отдели от GPCR и GBy субединицата.

Родопсинът съдържа протеин, наречен опсин, който притежава седем трансмембранни алфа спирали, допълнително свързани с поглъщащ светлина пигмент, ретината.

Родопсинът не е типичен GPCR, защото не разчита на лиганд. Изисква фотон-индуцирана изомеризация на неговия поглъщащ светлина пигмент (от 11-цис-ретинал до напълно транс--наричан още мета-родопсин II, или "активиран" родопсин, обозначен като "R*").

Това причинява конформационна промяна в спиралите на GPCR мембраната, позволявайки последващото свързване на Gat субединицата ("quott" означава трансдуцин, което е името на G-протеина, свързан с рецептора на родопсин) и позволява обмен на GDP за GTP.

След това Gat-GTP може да се освободи и да взаимодейства със своя ефекторен протеин, cGMP фосфодиестераза (PDE), който хидролизира cGMP до 5'-GMP.

синтезира цикличен аденозин монофосфат (цАМФ).

cAMP е вторичен месинджър. Веднъж синтезиран, cAMP може да трансдуцира различни физиологични сигнали.

Когато cAMP взаимодейства с протеин киназа A (PKA), която притежава две cAMP свързващи места: CNB-A и CNB-B. Когато cAMP се свърже с двете от тези места съвместно --- и киназната активност на PKA се активира.


Материали и методи

Клетъчна култура

HEK-293T човешки бъбречни фибробласти, HCT116+/+ и HCT116−/− човешки колоректални туморни клетки, заедно с WI38-T/Neo и WI38-T3 човешки ембрионални белодробни фибробласти бяха любезно предоставени от професор Varda Rotter (WIS). HEK-293T клетки се отглеждат в модифицирана среда на Dulbecco на Eagle, допълнена с 10% фетален телешки серум (FCS), 2 mM L-глутамин и антибиотици. WI-38 клетките се отглеждат в минимална есенциална среда (MEM), допълнена с 10% FCS, 1 mM натриев пируват, 2 mM L-глутамин и антибиотици. Клетките HCT116 се отглеждат в среда на McCoy, допълнена с 10% FCS, 2 mM L-глутамин и антибиотици.

Реагенти

BVDU (Sigma B9647) се разтваря в DDW до запаси от 1 μg/μl и се използва при крайна концентрация от 10 μg/ml. GCV: (Roche, закупен като лекарството Cymevene) се разтваря в DDW до запаси от 50 μg/μl и се използва при крайна концентрация от 100 μg/ml. Оцветяващ разтвор с кристално виолетово (CV): разтворът за оцветяване се състои от 1 g CV прах (Sigma C3886), 25 ml EtOH 99%, 225 ml DDW.

Доставка на ДНК

Клетките се поставят в плаки с шест ямки 48 часа преди трансфекцията, при първоначална плътност на клетките от (1) 10 4 WI38 клетки/ямка, (2) 2,5 × 10 5 HCT116 клетки/ямка и (3) 2,5 × 10 5 HEK- 293T клетки/ямка за луциферазни анализи или (3) 10 4 WI38 клетки/ямка и (4) 5 × 10 3 293T клетки/ямка за анализи за жизнеспособност. Трансфекциите бяха извършени с реагент за трансфекция FuGENE-HD (Roche, 04-709-691-001) съгласно протокола на производителя, със съотношение ДНК/реагент 2:7 за луциферазния анализ и 1,7:6 за анализа за клетъчна жизнеспособност, разреден в 100 μl редуцирана серумна среда (Opti-MEM, GIBCO 31985-047).

Плазмиди

Всички плазмидни карти са подробно описани в раздела за допълнителна информация.

Плазмиден p-промотор-1

Слетият протеин DocS/VP16-AD се регулира от човешки промотор, представляващ интерес („Промотор“). Плазмидът се състои от три модулни касети: (1) промоторът, който регулира слетия протеин (2) гена DocS и (3) незадължителната PEST последователност. Незадължителната PEST последователност се намира надолу по веригата до гена DocS. Състои се от аминокиселини 422–461 от гена на орнитин декарбоксилаза на мишка, което значително намалява живота на протеините, слети с него (Evan and Littlewood, 1998). Транслацията на PEST пептида изисква клониране на DocS/AD слят ген в рамките на PEST последователността. За да се изключи PEST последователността от слетия протеин, DocS последователността се клонира с низходящ STOP кодон. Същите плазмиди, в които дивият тип DocS е заменен с който и да е DocS15 или DocS102, са използвани за експерименти с мутант DocS.

Плазмиден p-промотор-2

Слетият протеин Coh2/GAL4-BD се регулира от дубликат на човешки промотор, представляващ интерес („Промотор“). Подобно на плазмид 1, плазмид 2 също има три модулни касети: (1) промоторът, който регулира слетия протеин (2) гена Coh2 и (3) незадължителната PEST последователност.

PG5-luc

Експресията на луцифераза на светулките се регулира от дрождевия GAL4 промотор. Генът на луциферазата е ограден от уникални рестрикционни места, които позволяват проста замяна на гена.

PG5-TK1

Този плазмид е идентичен с pG5-luc, с изключение на TK1 на мястото на луциферазния ген.

Плазмид pПромотор-5

Луциферазата на светулките се регулира директно от човешки промотор, представляващ интерес („Промотор“), който се използва за калибриране на входните нива на всеки човешки промотор. Плазмидът има три модулни касети: (1) промоторната област, (2) луциферазния ген и (3) незадължителна PEST последователност.

Плазмиден р-промотор-6

  • Плазмидите pPromoter-1+pPromoter-2 (входни плазмиди) и pG5-luc (плазмид на изходния модул) съдържат DPI с изход на луцифераза.
  • Плазмидите pPromoter-1+pPromoter-2 (входни плазмиди) и pG5-TK1 (изходен плазмид) включват DPI с TK1 изход.

Луциферазни анализи

Смесите от плазмиди, използвани при общо 2 μg ДНК / проба, са описани подробно в допълнителни таблици S1 и S2. Празен кръгов pGEM-t-Easy плазмид (Promega A3600) се използва като неспецифична ДНК, когато е необходимо, за да се завърши общата ДНК до 2 μg ДНК/проба. Клетките се събират 48 часа след трансфекцията, центрофугират се и се промиват с 1 ml PBS в 1.5-ml епруветка на Eppendorf. Измитата пелета се лизира с 50 μl лизисен буфер (Promega E194A) и нивата на активност на светулка и ренила луцифераза се измерват в 50 μl аликвотна част с Promega Dual-Luciferase® Reporter Assay kit (Promega E1980), в мулти-Victor четец на етикети (Perkin-Elmer), съгласно протокола на производителя. Ефективността на трансфекцията във всяка проба се оценява според нивата на активност на ренила луцифераза, която се експресира от плазмида pLXSN-Renilla, регулиран от стабилния вирусен LXSN промотор.

Анализ на клетъчната жизнеспособност

Преди посяването, шест-ямкови плаки бяха покрити с поли-L-лизин-хидробромид (Sigma P1274) за подобряване на клетъчната адхезия. Смесите от плазмиди, използвани при общо 1,7 μg ДНК / проба, са описани подробно в допълнителни таблици S3 и S4. Празният pGEM-t-Easy плазмид (Promega A3600) се използва като неспецифична ДНК, когато е необходимо, за да се завърши общото съдържание на ДНК до 1,7 μg ДНК/проба. Клетките се отглеждат 48 часа след трансфекцията в отсъствието на BVDU/GCV и общата експресия на GFP (генерирана от pCMV-GFP плазмида, в която експресията на GFP се регулира от мощния вирусен CMV промотор) във всяка ямка се измерва при 200 μM резолюция във флуоресцентния скенер Typhoon 9400 (Amersham). Това първоначално измерване на нетретирани клетки беше използвано за оценка на общата ефективност на трансфекция за всяка проба (допълнителна фигура S2). В този момент клетките се наблюдават под флуоресцентен микроскоп, за да се определи процента на GFP-позитивните клетки в културата, за да се оцени процентът на трансфектираните клетки. Скоро след извършване на измерването на GFP, клетките се инкубират в присъствието на 10 μg/ml BVDU (за HEK-293T) или 100 μg/ml GCV (WI38-T/Neo и WI38-T3), за да се активира цитотоксичността на TK1. CV оцветяване: Клетките се инкубират в продължение на 10 дни в присъствието на BVDU/GCV. След третиране клетките се промиват с 2 ml PBS, инкубират се за 15 минути с 1 ml CV разтвор и се промиват × 2 с 2 ml DDW. Плаките бяха изсушени и сканирани със скенер за изображения Canon 5200 за качествен анализ на плътността на клетките. За количествено определяне на плътността на клетките, CV оцветяването, имобилизирано във всяка проба, се разтваря в 1 ml 10% оцетна киселина/ямка. След това, 100 μl аликвоти се прехвърлят в 96-ямкови плаки и се измерват при OD590 в Synergy™ HT Multi-Mode Microplate Reader. Нормализиране на данните: За да се сравни ефектът от експресията на интегратора върху клетъчния растеж между клетъчните линии, данните трябваше да бъдат коригирани за два важни фактора, които влияят на крайната клетъчна плътност: Цитотоксичният ефект на процеса на трансфекция, който варира между клетъчните линии и различни скорости на пролиферация на клетъчните линии. Следователно, за всяка клетъчна линия клетъчната плътност (CVС) се нормализира според крайната плътност на отрицателна контролна проба (CVNC), в който изходът на експресионния интегратор е генът на луцифераза вместо TK1 и който се определя като 0% клетъчна смърт. Данните са показани като процент клетъчна смърт, който е изчислен като: където CVС е OD590 абсорбция на разтворения CV във всяка проба и CVNC е OD590 абсорбция на разтворения CV от отрицателната контролна проба.


Материали и методи

Щамове и плазмиди

Щамът, съдържащ библиотеката на синтетичния промотор, е получен от хаплоидния щам BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0), както е описано в Брахман et al (1998 г.). Библиотеката от промотори е конструирана в плазмид pJG102 (Gertz et al, 2009 г.). TF-GFP сливания са получени от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния) и са описани в Ghaemmaghami et al (2003) и Ха et al (2003 г.). За измерване на активността на Adr1 и Rgt1 сайтове, ние използвахме делеционни щамове BY4742 и MATα, получени от BY4742, описани в Brachmann et al (1998 г.). За да разгледаме активността на сайтовете Mig1/Mig2, използвахме BY4742 и Δmig1Δmig2 щам YM6682. YM6682, който е предоставен от Марк Джонстън, Вашингтонския университет, е създаден чрез чифтосване Δmig1 и Δmig2 хаплоидни щамове, като ги спорулират и селектират спори с двойно изтриване.

Изграждане на библиотека

За да създадем градивните елементи, които съставляват синтетичните промотори, използвахме процедурата и олигонуклеотидни двойки, описани в Gertz et al (2009) . Сайтът Gcr1, който използвахме беше:

Анализ на експресията

Всички култури се отглеждат при разклащане при 30°С. Култури от синтетични промоторни щамове (включително експерименти с делеция) се отглеждат до log фаза в 2 ml 96-ямкови плаки в 500 ul синтетична пълна среда без урацил с 2% глюкоза. „Глюкозните“ култури бяха фиксирани в този момент. За „диамидни“ култури, диамидът се добавя до крайна концентрация от 1,25 mM и се отглежда в продължение на 7 часа. Културите на „глад на аминокиселини“ първо се въртят надолу при 3000 g за 5 минути. Супернатантата се отстранява и се добавят 500 ul минимална среда, съдържаща 2% глюкоза и допълнена с хистидин, левцин, лизин и триптофан, и културите се отглеждат в продължение на 6 часа. Глицероловите култури първо се центрофугират при 3000 g за 5 минути. Супернатантата се отстранява и се добавят 500 ul синтетична пълна среда без урацил с 2% глицерол и културите се отглеждат в продължение на 16 часа. Сливането на TF-GFP се отглежда по същите начини, описани по-рано, с изключение на това, че към всяка среда се добавя урацил.

Each culture was fixed at the corresponding time point by adding a 4% paraformaldehyde solution (4% paraformaldehyde, 100 mM sucrose) to a final concentration of 1% and incubating at room temperature for 15 min. The cells were then spun down at 3000 g for 5 min. The supernatant was removed, and the cells were resuspended in 250 ul of phosphate-buffer saline and stored at 4°C.

The fluorescence intensities and electronic volumes of 25 000 events from each well were measured on a Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC with a multiplate loader. For each well, the mean of fluorescence divided by electronic volume for 25 000 events was taken as the expression value for that well. On each plate, the expression value of the four no insert controls were averaged to calculate a plate effect to account for changes in laser intensity or growth differences. Each expression value on the plate was then divided by the plate effect.

Sequencing

Synthetic promoters were sequenced and analyzed as described previously ( Gertz et al, 2009 ).

Thermodynamic model

All calculations were performed using the Matlab package from The Mathworks, Inc. (Natick, MA). To model gene expression, we implemented a thermodynamic model of polymerase occupancy that was proposed by Shea and Ackers (1985 ). The model and implementation was described previously in Gertz et al (2009) . In brief, the parameters that comprise the model are ϖ's that describe the changes in free energies from the binding of two proteins (TFs and/or RNAP) and q's for each protein that are confounded parameters. В q parameters represent the natural log of 1/Кд for the protein–DNA interaction plus the natural log of the active (meaning able to bind DNA) protein concentration. With these parameters, Boltzmann weights for each possible state of the promoter are calculated. Boltzmann weights are calculated by taking the sum of the q values for all DNA–protein interactions and ϖ values for all protein–protein interactions occurring in a particular state and exponentiating the negation of that sum. For instance, in a state where a TF and RNAP are bound to a promoter, the Boltzmann weight is equal to the exponentiation of −(qRNAP+qTF+ϖRNAP−TF). The probability of RNAP binding is then determined by dividing the sum of Boltzmann weights for the states with RNAP bound by the sum of Boltzmann weights for all states.

Different expression levels in different environments are modeled by changing the active TF concentrations and therefore the q стойности. This is because changes in free energies (ϖ и Кд) do not depend on environment. To fit expression levels, q values are allowed to change with the environments however, the q values in the reference environment (e.g., glycerol for gly- L ) are fixed at a neutral value of zero. As we are only measuring expression levels, q и ϖ values are dependent on each other. Следователно, q values can only describe relative changes in active TF concentrations.

To model competition between TFs for the same site, we allow the site to have three states: unbound, bound by the first TF, or bound by the second TF compared with two states: bound or unbound by the TF. Therefore, the only difference is that there are more states where Boltzmann weights need to be calculated. Once the Boltzmann weights are calculated, the weights are partitioned in the same way as described previously ( Gertz et al, 2009 ).

Parameter fitting

Parameters were fit for the thermodynamic models as described previously ( Gertz et al, 2009 г.). When fitting the models with competition, the initial guess for the parameter values was the final parameter fit for the model for the same library without competition and all zeros for parameters pertaining to the competing TF.

Cross-validation was performed by first partitioning the promoters randomly into 20% blocks. We removed one block at a time and fit parameters on the remaining 80%. The accuracy of the model was then measured on the block that was left out. This was repeated for all five blocks, and the results were combined to calculate the overall Р 2 of the cross-validation.


15.2 Прокариотна транскрипция

До края на този раздел ще можете да направите следното:

  • Избройте различните стъпки в прокариотната транскрипция
  • Обсъдете ролята на промоторите в прокариотната транскрипция
  • Опишете как и кога се прекратява транскрипцията

Прокариотите, които включват бактерии и археи, са предимно едноклетъчни организми, които по дефиниция нямат свързани с мембрана ядра и други органели. Бактериалната хромозома е затворен кръг, който за разлика от еукариотните хромозоми не е организиран около хистонови протеини. Централната област на клетката, в която се намира прокариотната ДНК, се нарича нуклеоидна област. В допълнение, прокариотите често имат изобилие от плазмиди, които са по-къси, кръгли ДНК молекули, които могат да съдържат само един или няколко гена. Плазмидите могат да се прехвърлят независимо от бактериалната хромозома по време на клетъчното делене и често носят черти като тези, свързани с антибиотична резистентност.

Транскрипцията в прокариотите (и при еукариотите) изисква двойната спирала на ДНК да се развие частично в областта на синтеза на иРНК. Областта на развиване се нарича транскрипционен балон. Транскрипцията винаги протича от една и съща ДНК верига за всеки ген, която се нарича шаблонна верига. Продуктът на иРНК е комплементарен на шаблонната верига и е почти идентичен с другата ДНК верига, наречена нешаблонна верига или кодираща верига. The only nucleotide difference is that in mRNA, all of the T nucleotides are replaced with U nucleotides (Figure 15.7). В двойна спирала на РНК, А може да свърже U чрез две водородни връзки, точно както при A-T сдвояване в двойна спирала на ДНК.

Нуклеотидната двойка в двойната спирала на ДНК, която съответства на мястото, от което се транскрибира първият 5' мРНК нуклеотид, се нарича +1 място или иницииращо място. Нуклеотидите, предхождащи мястото на иницииране, са обозначени с „-“ и са обозначени нуклеотиди нагоре по веригата. Обратно, нуклеотидите след мястото на иницииране се обозначават с номерация „+“ и се наричат нуклеотиди надолу по веригата.

Започване на транскрипция в прокариотите

Прокариотите нямат затворени в мембрана ядра. Следователно процесите на транскрипция, транслация и разграждане на иРНК могат да се проведат едновременно. The intracellular level of a bacterial protein can quickly be amplified by multiple transcription and translation events that occur concurrently on the same DNA template. Prokaryotic genomes are very compact, and prokaryotic transcripts often cover more than one gene or cistron (a coding sequence for a single protein). Polycistronic mRNAs are then translated to produce more than one kind of protein.

Нашата дискусия тук ще илюстрира транскрипцията, като опише този процес в Ешерихия коли, a well-studied eubacterial species. Въпреки че съществуват някои разлики между транскрипцията в Е. coli и транскрипция в археи, разбиране на Е. coli транскрипцията може да се приложи към почти всички бактериални видове.

Прокариотна РНК полимераза

Прокариотите използват една и съща РНК полимераза, за да транскрибират всичките си гени. В Е. coli, полимеразата е съставена от пет полипептидни субединици, две от които са идентични. Четири от тези субединици, обозначени α, α, β, и β', comprise the polymerase core enzyme . Тези субединици се събират всеки път, когато ген се транскрибира, и се разглобяват, след като транскрипцията приключи. Всяка субединица има уникална роля и двете α-субединиците са необходими за сглобяване на полимеразата върху ДНК β-subunit binds to the ribonucleoside triphosphate that will become part of the nascent mRNA molecule and the β' subunit binds the DNA template strand. Петата субединица, σ, участва само в инициирането на транскрипция. Той придава транскрипционна специфичност, така че полимеразата започва да синтезира иРНК от подходящо иницииращо място. Без σ, основният ензим ще транскрибира от произволни места и ще произведе молекули иРНК, които определят белтъчната глупост. Полимеразата, състояща се от всичките пет субединици, се нарича холоензим.

Прокариотни промотори

A promoter is a DNA sequence onto which the transcription machinery, including RNA polymerase, binds and initiates transcription. В повечето случаи промоторите съществуват преди гените, които регулират. Специфичната последователност на промотора е много важна, защото определя дали съответният ген се транскрибира през цялото време, част от времето или рядко. Although promoters vary among prokaryotic genomes, a few elements are evolutionarily conserved in many species. At the -10 and -35 regions upstream of the initiation site, there are two promoter consensus sequences, or regions that are similar across all promoters and across various bacterial species (Figure 15.8). The -10 sequence, called the -10 region, has the consensus sequence TATAAT. The -35 sequence has the consensus sequence TTGACA. These consensus sequences are recognized and bound by σ. След като се осъществи това взаимодействие, субединиците на основния ензим се свързват с мястото. A-T-богатият -10 регион улеснява развиването на ДНК шаблона и се създават няколко фосфодиестерни връзки. Фазата на иницииране на транскрипция завършва с производството на абортивни транскрипти, които са полимери от приблизително 10 нуклеотида, които се правят и освобождават.

Връзка към обучението

Вижте тази анимация на MolecularMovies, за да видите процеса на транскрипция, както се случва в клетката.

Elongation and Termination in Prokaryotes

The transcription elongation phase begins with the release of the σ субединица от полимеразата. Дисоциацията на σ позволява на основния ензим да продължи по протежение на ДНК шаблона, синтезирайки иРНК в посока 5' до 3' със скорост от приблизително 40 нуклеотида в секунда. Тъй като удължаването продължава, ДНК непрекъснато се развива пред основния ензим и се навива обратно зад него. Базовото сдвояване между ДНК и РНК не е достатъчно стабилно, за да поддържа стабилността на компонентите на синтеза на иРНК. Вместо това, РНК полимеразата действа като стабилен линкер между ДНК шаблона и зараждащите се РНК вериги, за да се гарантира, че удължаването няма да бъде прекъснато преждевременно.

Prokaryotic Termination Signals

Once a gene is transcribed, the prokaryotic polymerase needs to be instructed to dissociate from the DNA template and liberate the newly made mRNA. В зависимост от гена, който се транскрибира, има два вида сигнали за терминиране. Единият е базиран на протеини, а другият е на базата на РНК. Rho-зависимото завършване се контролира от rho протеина, който се проследява зад полимеразата върху растящата верига на иРНК. Близо до края на гена, полимеразата се натъква на серия от G нуклеотиди върху ДНК шаблона и тя спира. В резултат на това rho протеинът се сблъсква с полимеразата. Взаимодействието с rho освобождава иРНК от транскрипционния балон.

Rho-независимата терминация се контролира от специфични последователности в ДНК шаблонната верига. Тъй като полимеразата се приближава до края на транскрибирания ген, тя се натъква на регион, богат на C-G нуклеотиди. ИРНК се сгъва обратно върху себе си и комплементарните C-G нуклеотиди се свързват заедно. Резултатът е стабилна фиби, която кара полимеразата да спре веднага щом започне да транскрибира регион, богат на A-T нуклеотиди. Комплементарният U-A регион на транскрипта на иРНК образува само слабо взаимодействие с матрицата ДНК. Това, съчетано със спряната полимераза, предизвиква достатъчно нестабилност, за да може основният ензим да се откъсне и да освободи новия транскрипт на иРНК.

След прекратяване процесът на транскрипция е завършен. By the time termination occurs, the prokaryotic transcript would already have been used to begin synthesis of numerous copies of the encoded protein because these processes can occur concurrently. The unification of transcription, translation, and even mRNA degradation is possible because all of these processes occur in the same 5' to 3' direction, and because there is no membranous compartmentalization in the prokaryotic cell (Figure 15.9). In contrast, the presence of a nucleus in eukaryotic cells precludes simultaneous transcription and translation.

Връзка към обучението

Visit this BioStudio animation to see the process of prokaryotic transcription.


ВЪВЕДЕНИЕ

Transcription of eukaryotic genes is a highly complex and ordered process governed by a combination of trans-factors binding to distal cis-DNA sequence elements and general transcription factors (GTFs) assembling at the proximal core promoter. The stepwise assembly of a transcription preinitiation complex consisting of several GTFs, a mediator, and Pol II occurs stochastically. Once a transcription preinitiation complex (PIC) is fully assembled, multiple transcription reinitiation events lead to the rapid escape of a series of RNA Pol II polymerases, resulting in bursts of transcription (Blake et al., 2003). The number of transcripts generated during a burst varies according to its duration (Golding et al., 2005). The stochastic nature of transcription results in a heterogeneity of expression among cells in a population (Singh et al., 2010 г.). To characterize this quantal behavior of transcription in eukaryotic cells, several single-cell techniques have been developed, including single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH), FRET, and live cell imaging (Chen and Larson, 2016). These techniques have shown that bursting dynamics is highly varied among genes, with burst sizes ranging from two transcripts to hundreds, and periods of inactivity between bursts ranging from minutes to hours (Suter et al., 2011a, b Dar et al., 2012 Chen and Larson, 2016). Both burst size and frequency can vary among genes and within a single gene under different conditions, leading to modulated gene expression (Larson et al., 2013 Bartman et al., 2016 Fukaya et al., 2016).

Although the role of upstream enhancer elements in establishing bursting dynamics has been examined, the role of core promoter elements, with the exception of the TATAA box (Blake et al., 2006 Hornung et al., 2012 Ravarani et al., 2016 Tantale et al., 2016), has not. The core promoter encompasses the transcription start site and is defined as the 50–100 base pair region within which transcription initiates (Sandelin et al., 2007 Roy and Singer, 2015). Canonical core promoter elements, such as the TATAA box and Initiator (Inr), are commonly found in promoters, although many promoters have no identifiable core promoter elements. The composition of core promoters (Larson et al., 2013) is loosely correlated with the type of genes they regulate: tissue-specific genes are enriched for TATAA box and Inr elements, whereas promoters of housekeeping genes often contain Inr, TCT, DPE, DCE, or other motifs (Zabidi et al., 2015).

Recent evidence demonstrates that the core promoter is not, as previously thought, a passive platform upon which regulation is imposed by mediator and transcription factors. Rather, it actively contributes to the regulation of gene expression. In the case of major histocompatibility complex (MHC) class I genes, individual core promoter elements contribute to the overall regulation of transcription (Barbash et al., 2013). MHC class I genes encode cell surface receptors that present intracellularly-derived peptides, eliciting cellular immunity against intracellular pathogens. Consistent with this role of providing immune surveillance, MHC class I genes are ubiquitously expressed, although their levels of RNA vary dramatically among tissues. Expression is constitutively highest in lymphoid cells, such as B-cells, and lower to varying degrees in other tissues. Expression is dynamically modulated by hormones and cytokines, which decrease and increase levels, respectively. Thus MHC class I transcription is subject to both intracellular, tissue-specific and extracellular, hormone/cytokine regulatory pathways that converge on, and are integrated at, the core promoter.

These complex patterns of MHC class I gene expression make it an ideal model system in which to study the molecular mechanisms of transcriptional regulation. We have shown previously that expression of a transgene derived from the porcine MHC class I gene, PD1, is indistinguishable both from its endogenous pattern of expression and from the endogenous mouse MHC class I genes (Frels et al., 1985). The PD1 transgene contains all of the regulatory elements required for normal tissue-specific and hormone/cytokine-mediated patterns of expression (Ehrlich et al., 1989). The core promoter of the PD1 gene extends from –68 to +14 base pairs and consists of 1) a TATAA-like element, 2) an Inr, 3) a CCAAT box and 4) an Sp1 binding site (Sp1BS) and actively contributes to the regulation of transcription of the PD1 transgene. Surprisingly, mutation of any one of these elements results in increased transcription (without altering transcription start site usage), defining these as negative regulators of transcription that differentially regulate either tissue specific expression, interferon response, or both (Barbash et al., 2013). Thus the individual core promoter elements actively participate in the integration of both tissue-specific and hormonal upstream regulatory signals to achieve appropriate levels of transcription (Barbash et al., 2013).

The finding that the individual core promoter elements have distinct effects on the regulation of MHC class I transcription led to the question of their role(s) in transcriptional bursting. Here we report that transcription of the MHC class I gene PD1 occurs in bursts and that the individual core promoter elements contribute differentially to establishing the overall bursting pattern in a context-dependent manner. In primary splenic B-cells during basal transcription, burst size is modulated primarily by the Sp1BS, while the Inr establishes burst frequency. The TATAA-like element governs both burst size and frequency. Their individual contributions change in response to transcriptional activation by the cytokine γ-interferon. This plasticity in regulating the bursting of MHC class I transcription enables rapid fine-tuning of transcription levels to respond to intrinsic and extrinsic signaling events, such as viral infections.


Hanahan, D. and Weinberg, R.A. The hallmarks of cancer. клетка 100 (2000) 57–70.

Evan, G.I. and Vousden, K.H. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer. природата 411 (2001) 342–348.

Salvesen, G.S. and Duckett, C.S. IAP proteins: blocking the road to death’s door. Natl. преп. мол. Клетъчна биол. 3 (2002) 401–410.

Li, F. and Altieri, D.C. The caner anti-apoptosis mouse survivin gene: characterization of locus and transcriptional requirements of basal and cell cycle-dependent expression. Cancer Res. 59 (1999) 3142–3151.

Altieri, D.C. Validating survivin as a cancer therapeutic target. Нац. Преподобният рак 3 (2003) 46–54.

Altieri, D.C. Molecular circuits of apoptosis regulation and cell division control: The survivin paradigm. J. Cell. Biochem. 92 (2004) 656–663.

Altieri, D.C. Targeted therapy by disabling crossroad signaling networks: the survivin paradigm. Mol. Cancer Ther. 5 (2006) 478–482.

Dohi, T., Beltrami, E., Wall, N.R., Plescia, J. and Altieri, D.C. Mitochondrial survivin inhibits apoptosis and promotes tumorigenesis. J. Clin. Инвестирам. 114 (2004) 1117–1127.

Ambrosini, G., Adida, C. and Altieri, D.C. A novel anti-apoptotic gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. Нац. Мед. 3 (1997) 917–921.

Adida, C., Crotty, P.L., McGrath, J., Berrebi, D., Diebold, J. and Altieri, D.C. Developmentally regulated expression of the novel cancer antiapoptosis gene survivin in human and mouse differentiation. Am. J. Pathol. 152 (1998) 43–49.

Fukuda, S. and Pelus, L.M. Regulation of the inhibitor-of-apoptosis family member survivin in normal cord blood and bone marrow CD34+ cells by hematopoietic growth factors: Implications of survivin expression in normal hematopoiesis. кръв 98 (2001) 2091–2100.

Altieri, D.C. Survivin and apoptosis control. адв. Cancer Res. 88 (2003) 31–52.

Johnson, M.E. and Howerth, E.W. Survivin: a bifunctional inhibitor of apoptosis protein. Vet. Патол. 41 (2004) 599–607.

Lo Muzio, L., Pannone, G., Leonardi, R., Staibano, S., Mignogna, M.D., De Rosa, G., Kudo, Y., Takata, T. and Altieri, D.C. Survivin, a potential early predictor of tumor progression in the oral mucosa. J. Dent. Рез. 82 (2003) 923–928.

Lo Muzio, L., Pannone, G., Staibano, S., Mignogna, M.D., Rubini, C., Mariggiò, M.A., Procaccini, M., Ferrari, F., De Rosa, G. and Altieri, D.C. Survivin expression in oral squamous cell carcinoma. Brit. J. Рак 89 (2003) 2244–2248.

Lo Muzio, L., Campisi, G., Giovanelli, L., Ammatuna, P., Greco, I., Staibano, S., Pannone, G., De Rosa, G., Di Liberto, C. and D’Angelo, M. HPV DNA and survivin expression in epithelial oral carcinogenesis: a relationship? Oral Oncol. 40 (2004) 736–741.

Tanaka, C., Uzawa, K., Shibahara, T., Yokoe, H., Noma, H. and Tanzawa, H. Expression of an inhibitor of apoptosis, survivin, in oral carcinogenesis. J. Dent. Рез. 82 (2003) 607–811.

Lin, C.Y., Hung, H.C., Kuo, H.C., Chiang, C.P. and Kuo, M.Y. Survivin expression predicts poorer prognosis in patients with areca quid chewingrelated oral squamous cell carcinoma in Taiwan. Oral Oncol. 41 (2005) 645–654.

Bao, R., Connolly, D.C., Murphy, M., Green, J., Weinstein, J.K., Pisarcik, D.A. and Hamilton, T. Activation of cancer-specific gene expression by the survivin promoter. J. Natl. Рак Inst. 94 (2002) 522–528.

Chiou, S., Jones, M.K. and Tarnawski, A.S. Survivin- an anti-apoptosis protein: its biological roles and implications for cancer and beyond. Мед. Sci. Monit. 9 (2003) P143–P147.

Chen, J.S., Liu, J.C., Shen, L., Rau, K.M., Kuo, H.P., Li, Y.M., Shi, D., Lee, Y.C., Chang, K.J. and Hung, M.C. Cancer-specific activation of the survivin promoter and its potential use in gene therapy. Cancer Gene Ther. 11 (2004) 740–747.

Scully, C. Oral precancer: preventive and medical approaches to management. Евро. J. Cancer B Oral Oncol. 31(B) (1995) 16–26.

Schepman, K., der Meij, E., Smeele, L. and der Waal, I. Concomitant leukoplakia in patients with oral squamous cell carcinoma. Oral. Dis. 5 (1999) 206–209.

Choi, S. and Myers, J.N. Molecular pathogenesis of oral squamous cell carcinoma: implications for therapy. J. Dent. Рез. 87 (2007) 14–32.

Lo Muzio, L., Staibano, S., Pannone, G., Mignona, M.D., Mariggio, A., Salvatore, G., Chieffi, P., Tramontano, D., De Rosa, G. and Altieri D.C. Expression of the apoptosis inhibitor survivin in aggressive squamous cell carcinoma. Exp. Mol. Патол. 70 (2001) 249–254.

Lo Muzio, L. Farina, A., Rubini, C., Pezzetti, F., Stabellini, G., Laino, G., Santarelli, A., Pannone, G., Bufo, P., de Lillo, A. and Carinci, F. Survivin as prognostic factor in squamous cell carcinoma of the oral cavity. Рак Lett. 225 (2005) 27–33.

Harras, A., Edwards, B.K., Blot, W.J. and Ries, L.A. Cancer rates and risks. National Institutes of Health, Bethesda, MD. NIH Publication (1996) No. 96–691.

Silverman, S. Jr. Oral cancer: complication of therapy. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 88 (1999) 122–126.

Shillitoe, E.J. Gene therapy for oral cancer: recent progress in research. Oral Oncol. 34 (1998) 157–160.

Xi, S. and Grandis, J.R. Gene therapy for the treatment of oral squamous cell carcinoma. J. Dental. Рез. 82 (2003) 11–16.

Ladeinde, A.L., Ogunlewe, M.O., Adeyemo, W.L. and Bamgbose, B.O. Gene therapy in the management of oral cancer: a review of recent documents. Niger. Postgrad. Мед. Дж. 12 (2005) 18–22.

Gibbs J.B. Mechanism based target identification and drug discovery in cancer research. наука 287 (2000) 1969–1973.

Hart, I.R. Tissue specific promoters in targeting systemically delivered gene therapy. Семин. Oncol. 23 (1996) 154–158.

O’Malley, B.W., Cope, K.A., Chen, S.-H., Li, D., Schwartz, M.R. and Woo, S.L.C. Combination gene therapy for oral cancer in a murine model. Cancer Res. 56 (1996) 1737–1741.

O’Malley, B.W., Cope, K.A., Johnson, C.S. and Schwartz, M.R. A new immunocompetent murine model for oral cancer. арх. Otolaryngol. Head Neck Surg. 123 (1997) 20–24.

Yen, A., Overlid, N., Li, F., Düzgüneş N. and Konopka, K. Survivin promoter-driven gene expression in human oral cancer cells. The 85th General Session of the International Association for Dental Research and 36th Annual Meeting of the American Association for Dental Research, New Orleans, LA, 2007, J. Dent. Рез. 86 (Special issue A) Abstract No. 0758, Seq. #98.

Spain, C., Overlid, N., Li, F., Düzgüneş, N. and Konopka, K. Murine survivin promoter-driven gene expression in cancer and non-tumor cells. International Association for Dental Research and 36th Annual Meeting of the American Association for Dental Research, New Orleans, LA, 2007, J. Dent. Рез. 86 (Special issue A) Abstract No. 2394, Seq. #240.

Li, F. and Altieri, D.C. Transcriptional analysis of human survivin gene expression. Biochem. Дж. 344 (1999) 305–311.

Yang, L., Cao, Z., Li, F., Post, D.E., Van Meir, E.G., Zhong, H. and Wood, W.C. Tumor-specific gene expression using the survivin promoter is further increased by hypoxia. Gene Ther. 11 (2004) 1215–1223.

Zhu, Z.B., Makhija, S.K., Lu, B., Wang, M., Kaliberova, L., Liu, B., Rivera, A.A., Nettelbeck, D.M., Mahasreshti, P.J., Leath III, C.A., Barker, S., Yamaoto, M., Li, F., Alvarez, R.D. and Curiel D.T. Transcriptional targeting of tumors with a novel tumor-specific survivin promoter. Cancer Gene Ther. 11 (2004) 256–262.

Matsumoto, K., Horikoshi, M., Rikimaru, K. and Enomoto, S. A study of an in vitro model for invasion of oral squamous cell carcinoma. J. Oral Pathol. Мед. 18 (1989) 498–501.

Prime, S.S., Nixon, S.V.R., Crane, I.J., Stone, A., Matthews, J.B., Maitland, N.J., Remnant, L., Powell, S.K., Game, S.M. and Scully, C. The behaviour of human oral squamous cell carcinoma in cell culture. J. Pathol. 160 (1990) 259–269.

Eagle, H. Propagation in a fluid medium of a human epidermoid carcinoma strain KB. Proc. Soc. Exp. Biol. Мед. 89 (1955) 362–364.

Gilchrist, E.P., Moyer M.P., Shillitoe, E.J., Clare, N. and Murrah, V.A. Establishment of a human polyclonal oral epithelial cell line. Oral Surg. Oral Med Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 90 (2000) 340–347.

Stampfer, M.R. and Bartley, J.C. Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzeno(a)pyrene. Proc. Нац. Акад. Sci. 82 (1985) 2394–2398.

Walen, K.H. and Stampfer, M.R. Chromosome analyses of human mammary epithelial cells at stages of chemical-induced transformation progression to immortality. Cancer Genet. Cytogenet. 37 (1989) 249–261.

Fu, K.K., Rayner, P.A. and Lam, K.N. Modification of the effects of continuous low dose irradiation by concurrent chemotherapy infusion. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. физ. 10 (1984) 1473–1478.

Jainchill, J.L., Aaronson, S.A., and Todaro, G.J. Murine sarcoma and leukemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells. J. Virol. 4 (1969) 549–553.

Owens, R.B., Smith, H.S. and Hackett, A.J. Epithelial cell cultures from normal glandular tissue of mice. J. Natl. Рак Inst. 53 (1974) 261–269.

Konopka, K. Fallah, B., Monzon-Duller, J., Overlid, N. and Düzgüneş, N. Serum-resistant gene transfer to oral cancer cells by Metafectene and GeneJammer: Application to HSV-tk/ganciclovir-mediated cytotoxicity. клетка. Mol. Biol. Lett. 10 (2005) 455–470.

Fields, R.D. and Lancaster, M.V. Dual-attribute continuous monitoring of cell proliferation/cytotoxicity. Am. Биотехнология. Lab. 11 (1993) 48–50.

Konopka, K., Pretzer, E., Felgner, P.L. and Düzgüneş, N. Human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) infection increases the sensitivity of macrophages and THP-1 cells to cytotoxicity by cationic liposomes. Biochim. Биофиз. Acta 1312 (1996) 186-196.

Konopka, K., Overlid, N., Nagaraj, A.C. and Düzgüneş, N. Serum decreases the size of Metafectene- and GeneJammer-DNA complexes but does not affect significantly their transfection activity in SCCVII squamous cell carcinoma cells. клетка. Mol. Biol. Lett. 11 (2006) 171–190.

Bandyopadhyay, A., Cibull, M.L. and Sun, L. Isolation and characterization of a spontaneously transformed mouse mammary epithelial cell line in culture. Канцерогенеза 19 (1998) 1907–1911.

Zhu, Z.B., Makhija, S.K., Lu, B., Wang, M., Wang, S., Takayama, K., Siegal, G.P., Reynolds, P.N. and Curiel D.T. Targeting mesothelioma using an infectivity enhanced survivin-conditionally replicative adenoviruses. J. Thorac. Oncol. 1 (2006) 701–711.

Li, B., Liu, X., Fan, J., Qi, R., Bo, L., Gu, J., Qian, Q., Qian, C. and Liu, X. A survivin-mediated oncolytic adenovirus induces non-apoptotic cell death in lung cancer cells and shows antitumoral potential in vivo. J. Gene Med. 8 (2006) 1232–1242.

Ulasov, I.V., Zhu, Z.B., Tyler, M.A., Han, Y., Rivera, A.A., Khramtsov, A., Curiel, D.T. and Lesniak, M.S. Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma. Хъм Gene Ther. 18 (2007) 589–602.

Kamizono, J., Nagano, S., Murofushi, Y., Komiya, S., Fujiwara, H., Matsuishi, T. and Kosai, K. Survivin-responsive conditionally replicating adenovirus exhibits cancer-specific and efficient viral replication. Cancer Res. 65 (2005) 5284–5291.

Xu, Y., Fang, F., Ludewig, G., Jones, G. and Jones, D. A mutation found in the promoter region of the human survivin gene is correlated to overexpression of survivin in cancer cells. ДНК клетъчна биол. 23 (2004) 527–537.

Jang, J.S., Kim, K.M., Kang, K.H., Choi, J.E., Lee, W.K., Kim, C.H., Kang, Y.M., Kam, S., Kim, I.S., Jun, J.E. and Park, J.Y. Polymorphisms in the survivin gene and the risk of lung cancer. Lung Cancer 60 (2008) 31–39.

Borbely, A.A., Murvai, M., Szarka, K., Konya, J., Gergely, L., Hernadi, Z. and Veress, G. Survivin promoter polymorphism and cervical carcinogenesis. J. Clin. Патол. 60 (2007) 303–306.

Kappler, M., Kotzsch, M., Bartel, F., Füssel, S., Lautenschläger, C., Schmidt, U., Würl, P., Bache, M., Schmidt, H., Taubert, H. and Meye, A. Elevated expression level of survivin protein in soft-tissue sarcomas is a strong independent predictor of survival. Clin. Cancer Res. 9 (2003) 1098–1104.


Електронен допълнителен материал

Figure S1: Schematic representation of

Additional file 1: NDUFV1 upstream region. 3665 bp-long NUS sequence contains highly conserved 91 bp-long genomic fragment located exactly upstream NDUFV1 transcriptional start site. At the 5' terminus of NUS there is an insert of HERV-K (HML-2) solitary LTR. (TIFF 78 KB)

12896_2010_526_MOESM2_ESM.TIFF

Additional file 2: Figure S2: Comparison of herpes virus thymidine kinase promoter - driven renillaluciferase activities in cell lines Tera-1, NGP127, HepG2, A549 and HEK293. The column height reflects the mean value of detected luciferase activity from at least six transfection experiments, and error bars indicate the value of a standard error. Each experiment was made at least in quadruplicate. (TIFF 102 KB)

12896_2010_526_MOESM3_ESM.TIFF

Additional file 3: Figure S3: Comparison of mNUS and CMV promoter activities in cell lines Tera-1 and HEK293. The column height reflects the mean value of relative luciferase activity from at least four transfections, and error bars indicate the value of a standard error. (TIFF 126 KB)

12896_2010_526_MOESM4_ESM.TIFF

Additional file 4: Figure S4: Schematic map of the putative transcriptional factor binding sites within the 3665 bp-long entire NUS region. HERV-K(HML-2) LTR sequence and 91 bp-long deletion are shown by magenta boxes. Signs above/below represent putative transcription factor binding sites identified in the sense/antisense orientations, respectively. Large red circle represent putative SRY/SOX3 binding site perfectly matching the consensus sequence (ACAAAACA), small circles - sites with single nucleotide mismatches. The detailed data on transcriptional factor binding sites is presented on the additional table 1. (TIFF 53 KB)


Гледай видеото: Евгений Шеваль: Живая клетка: порядок из хаоса (Може 2022).