Информация

Коя културална среда е подходяща за епителни клетки на бузите?

Коя културална среда е подходяща за епителни клетки на бузите?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Преди месец се опитах да изолирам клетки на бузите от слюнката и експериментът беше успешен, но се чудех дали е възможно тези клетки да се култивират in vitro. Бих казал, че е възможно, но не успях да намеря публикации по тази тема онлайн, дори в PubMed (намерих такава, но беше остаряла и частта с използваните медии не беше ясна). Възможно ли е да се използва само DMEM носител и ако да, колко дълго ще оцелеят клетките в средата или има други алтернативи?


Първична клетъчна култура: 3 техники (с диаграма)

Първичната култура като цяло включва техниките на култивиране, извършвани след изолирането на клетките, но преди първата субкултура. Първичните култури обикновено се приготвят от големи тъканни маси. По този начин, тези култури могат да съдържат различни диференцирани клетки, напр. фибробласти, лимфоцити, макрофаги, епителни клетки.

С опита на персонала, работещ в лаборатории за тъканни култури, се вземат предвид следните критерии/характеристики за ефективно развитие на първични култури:

а. За първични култури се предпочитат ембрионални тъкани, отколкото тъкани на възрастни. Това се дължи на факта, че ембрионалните клетки могат лесно да бъдат дезагрегирани и да дадат по-жизнеспособни клетки, освен че бързо пролиферират in vitro.

б. Количеството клетки, използвани в първичната култура, трябва да бъде по-високо, тъй като степента на оцеляване е значително по-ниска (в сравнение със субкултурите).

° С. Тъканите трябва да бъдат обработени с минимално увреждане на клетките за използване в първична култура. Освен това мъртвите клетки трябва да бъдат отстранени.

д. Препоръчително е да изберете подходяща среда (за предпочитане богата на хранителни вещества). За добавяне на серум се предпочита фетален говежди източник, отколкото телешки или конски серум.

д. Необходимо е да се отстранят ензимите, използвани за дезагрегация на клетките чрез центрофугиране.

Техники за първична култура:

Сред различните техники, разработени за първична култура на изолирани тъкани, най-често се използват три техники:

1. Механична дезагрегация.

2. Ензимна дезагрегация.

3. Техника на първична експлантация.

Очертанието на тези техники е изобразено на фиг. 36.1, а процедурите са описани накратко:

Техника № 1. Механична дезагрегация:

За дезагрегацията на меките тъкани (например далак, мозък, ембрионален черен дроб, меки тумори) обикновено се използва механична техника. Тази техника основно включва внимателно нарязване или нарязване на тъкани на парчета и събиране на разпръснати клетки.

Клетките могат да бъдат събрани по два начина:

и Притискане на парчетата тъкан през серия от сита с постепенно намаляване на размера на окото.

ii. Насилване на тъканните фрагменти през спринцовка и игла.

Въпреки че механичното дезагрегация включва риск от увреждане на клетките, процедурата е по-евтина, бърза и проста. Тази техника е особено полезна, когато наличността на тъканта е в изобилие и ефективността на добива не е много важна. Трябва обаче да се отбележи, че жизнеспособността на клетките, получени чрез механични техники, е много по-ниска от ензимната техника.

Техника № 2. Ензимна дезагрегация:

Ензимната дезагрегация се използва най-вече, когато се изисква високо възстановяване на клетки от тъкан. Дезагрегацията на ембрионалните тъкани е по-ефективна с по-висок добив на клетки чрез използване на ензими. Това се дължи на наличието на по-малко фиброзна съединителна тъкан и извънклетъчен матрикс. Ензимната дезагрегация може да се извърши с помощта на трипсин, колагеназа или някои други ензими.

Дезагрегация по трипсин:

Терминът трипсинизация обикновено се използва за дезагрегация на тъканите от ензима трипсин.

Много работници предпочитат да използват суров трипсин, а не чист трипсин поради следните причини:

и Суровият трипсин е по-ефективен поради наличието на други протеази

ii. Клетките могат да понасят по-добре суровия трипсин.

iii. Остатъчната активност на суровия трипсин може лесно да се неутрализира от серума на хранителната среда (когато се използва среда без серум, за неутрализиране може да се използва инхибитор на трипсина).

Дезагрегацията на клетките може да се извърши и чрез използване на чист трипсин, който е по-малко токсичен и по-специфичен в своето действие. Желаната тъкан се нарязва на парчета 2-3 mm и след това се подлага на дезагрегация с трипсин. Има две техники на трипсинизация – топла трипсинизация и студена трипсинизация (фиг. 36.2).

Топла трипсинизация (фиг. 36.2A):

Този метод се използва широко за дезагрегация на клетки. Нарязаната тъкан се промива с дисекция на базален солев разтвор (DBSS) и след това се прехвърля в колба, съдържаща топъл трипсин (37°С). Съдържанието се разбърква и на интервал от всеки тридесет минути може да се събере супернатантата, съдържаща дисоциираните клетки. След отстраняване на трипсина, клетките се диспергират в подходяща среда и се консервират (като се държи флакона върху лед).

Процесът на добавяне на пресен трипсин (към парчетата тъкан), инкубиране и събиране на дисоциирани клетки (на интервали от 30 минути) се извършва за около 4 часа. Дезагрегираните клетки се събират, преброяват, разреждат се подходящо и след това се инкубират.

Студена трипсинизация (фиг. 36.2B):

Тази техника е по-подходящо да се нарича трипсинизация със студено предварително излагане. Рискът от увреждане на клетките при продължително излагане на трипсин при 37°C (при топла трипсинизация) може да бъде сведен до минимум при тази техника.

След нарязване и измиване парчетата тъкан се съхраняват във флакон (върху лед) и се накисват със студен трипсин за около 6-24 часа. Трипсинът се отстранява и се изхвърля. Въпреки това, парчетата тъкан съдържат остатъчен трипсин. Тези парчета тъкан в среда се инкубират при 37°С за 20-30 минути. Клетките се разпръскват чрез многократни пи-петтинги. Дисоциираните клетки могат да бъдат преброени, разредени по подходящ начин и след това използвани.

Методът на студена трипсинизация обикновено води до по-висок добив на жизнеспособни клетки с подобрена преживяемост на клетките след 24 часа инкубация. Този метод не включва разбъркване или центрофугиране и може удобно да се използва в лаборатория. Основното ограничение на студената трипсинизация е, че тя не е подходяща за дезагрегация на клетки от големи количества тъкани.

Ограничения на дезагрегацията на трипсина:

Дезагрегацията от трипсин може да увреди някои клетки (например епителни клетки) или може да бъде почти неефективна за определени тъкани (например фиброзна съединителна тъкан). Следователно други ензими също се използват за дисоциация на клетките.

Дезагрегация по колагеназа:

Колагенът е най-разпространеният структурен протеин във висшите животни. Той присъства главно в извънклетъчния матрикс на съединителната тъкан и мускулите. Ензимът колагеназа (обикновено суров, замърсен с неспецифични протеази) може ефективно да се използва за дезагрегация на няколко тъкани (нормални или злокачествени), които могат да бъдат чувствителни към трипсин.

Изпробвани са високо пречистени степени на колагеназа, но те са по-малко ефективни в сравнение със суровата колагеназа. Важните етапи в колагеназната дезагрегация, изобразени на фиг. 36.3, са описани накратко по-долу.

Желаната тъкан, суспендирана в базален солев разтвор, съдържащ антибиотици, се нарязва на парчета. Тези парчета се промиват чрез утаяване и след това се суспендират в пълна среда, съдържаща колагеназа. След инкубиране в продължение на 1-5 дни, парчетата тъкан се диспергират чрез пипетиране. Гроздовете от клетки се разделят чрез утаяване. Епителните клетки и фибробластните клетки могат да бъдат разделени.

Колагеназната дезагрегация се използва успешно за човешки мозък, бели дробове и няколко други епителни тъкани, освен различни човешки тумори и други животински тъкани. Добавянето на друг ензим хиалуронидаза (действа върху въглехидратните остатъци върху клетъчните повърхности) насърчава дезагрегацията.

Установено е, че колагеназата в комбинация с хиалуронидаза е много ефективна за дисоцииране на черния дроб на плъх или заек. Това може да стане чрез перфузия на целия орган in situ. Някои работници използват колагеназа във връзка с трипсин, формулировка, разработена в пилешки серум, за дезагрегация на определени тъкани.

Използване на други ензими при дезагрегация:

Трипсинът и колагеназата са най-широко използваните ензими за дезагрегация. Някои бактериални протеази (например проназа, диспаза) са използвани с ограничен успех. Освен хиалуронидаза, невраминидазата се използва и във връзка с колагеназата за ефективно разграждане на въглехидратите на клетъчната повърхност.

Техника № 3. Техника за първична експлантация:

Основната техника за експлантиране всъщност е оригиналният метод, разработен от Харисън през 1907 г. Тази техника е претърпяла няколко модификации и все още се използва. Опростената процедура, възприета за култура на първичен експлант, е изобразена на Фиг. 36.4 и е описана накратко по-долу.

Тъканта в разтвор на базална сол се нарязва на ситно и се измива чрез утаяване. След това разтворът на базалната сол се отстранява. Парчетата тъкан се разпределят равномерно по повърхността на растежа. След добавяне на подходяща среда, инкубацията се извършва в продължение на 3-5 дни. След това средата се сменя на седмични интервали, докато се наблюдава значителен растеж на клетките. Сега експлантите се отстраняват и се прехвърлят в съд за свежа култура.

Техниката на първичния експлант е особено полезна за дезагрегация на малки количества тъкани (например кожни биопсии). Другите две техники за механична или ензимна дезагрегация обаче не са подходящи за малки количества тъкани, тъй като съществува риск от загуба на клетките.

Ограничението на техниката на експлантиране е лошата адхезия на определени тъкани към повърхността на растежа и селекцията на клетки в израстъка. Наблюдава се обаче, че техниката за първичен експлант може да се използва за повечето ембрионални клетки, напр. фибробласти, миобласти, епителни клетки, глиални клетки.

Разделяне на жизнеспособни и нежизнеспособни клетки:

Обичайна практика е да се отстранят нежизнеспособните клетки, докато първичната култура се приготвя от дезагрегираните клетки. Това обикновено се прави при първата смяна на средата. Много малкото останали нежизнеспособни клетки се разреждат и постепенно изчезват, когато пролиферацията на жизнеспособни клетки започне.

Понякога нежизнеспособните клетки от първичните култури могат да бъдат отстранени чрез центрофугиране. Клетките се смесват с фикол и натриев метризоат и се центрофугират. Мъртвите клетки образуват пелета на дъното на епруветката.

Медицинска етика и мерки за безопасност в културните техники:

Тъй като културните техники включват използването на животински или човешки тъкани, е абсолютно необходимо да се спазват няколко мерки за безопасност и медицинска етика. Всъщност в някои страни има установено законодателство/норми за подбор и използване на тъкани в култури. Например в Обединеното кралство се следва Законът за експерименти с животни (научни процедури) от 1986 г.

Работата с човешки тъкани създава няколко проблема, които обикновено не се срещат при животинските тъкани. При работа с фетални материали и човешки биопсии се изисква съгласието на пациента и/нейните близки, освен съгласието на местната етична комисия. Освен това, вземането на тъкани (дори и в малки количества) от човешки донори изисква пълното съгласие на донора в предписан формат.

Следните въпроси трябва да бъдат взети под внимание при работа с човешки тъкани:

1. Съгласието на пациента и/или близките за използване на тъкани за изследователски цели.

2. Притежание на разработените клетъчни линии и техните производни.

3. Съгласие за генетична модификация на клетъчните линии.

6. Патентни права за всяка търговска употреба на клетъчни линии.

В общата практика на културни техники, използващи човешки тъкани, донорът и/или роднините са помолени да подпишат декларация за отказ от отговорност (в предписана проформа), преди тъканта да бъде взета. С този подход правните усложнения са сведени до минимум.

Работата с човешки тъкани е свързана с голям риск от излагане на различни инфекции. Следователно е абсолютно необходимо човешките материали да се обработват в шкаф за биологична опасност. Тъканите трябва да бъдат изследвани за различни инфекции като хепатит, туберкулоза, ХИВ, преди употребата им. Освен това, медиите и апаратите, след употребата им, трябва да бъдат автоклавирани или дезинфекцирани, така че разпространението на инфекции да се намали драстично.


Полезни числа за клетъчната култура

Има различни размери съдове и колби, използвани за клетъчни култури. Някои полезни числа като повърхностна площ и обеми на разтворите на дисоциация са дадени по-долу за различни по размер съдове за култура.

Каталожен номерПлощ на повърхността (см 2 )Плътност на засяване*Клетки при сливане*Версен
(mL от 0,05% EDTA). Прибл. сила на звука
Трипсин
(mL 0,05% трипсин, 0,53 mM EDTA). Прибл. сила на звука
Среда за растеж
(mL). Прибл. сила на звука
Съдове
35 мм1504601503188.80,3 x 10 6 1,2 x 10 6 112
60 мм15046215028821.50,8 x 10 6 3,2 x 10 6 335
100 мм15046415035056.72,2 х 10 6 8,8 x 10 6 5512
150 мм1504681683811455,0 x 10 6 20,0 x 10 6 101030
Културни плочи
6-ямка1406759.60,3 x 10 6 1,2 x 10 6 111 до 3
12-кладенец1506283.50,1 x 10 6 0,5 х 10 6 0,4 до 10,4 до 11 до 2
24-кладенец1424751.90,05 x 10 6 0,24 x 10 6 0,2 до 0,30,2 до 0,30,5 до 1,0
48-кладенец1506871.10,03 x 10 6 0,12 x 10 6 0,1 до 0,20,1 до 0,20,2 до 0,4
96-кладенец1670080.320.01 10 6 0,04 x 10 6 0,05 до 0,10,05 до 0,10,1 до 0,2
Колби
Т-25156367156340250,7 x 10 6 2,8 x 10 6 333–5
Т-75156499156472752,1 x 10 6 8,4 x 10 6 558–15
Т-1751599101599201754,9 x 10 6 23,3 x 10 6 171735–53
Т-2251599341599332256,3 х 10 6 30 x 10 6 222245–68
*Плътността на засяване е дадена за всеки тип съд за култура, както следва: Чинии и колби: Клетки на съд Културни плаки: Клетки на ямка.

†Броят на клетките в сливаща се чиния, чиния или колба ще варира в зависимост от типа клетка. За тази таблица бяха използвани HeLa клетки.


Светлинна микроскопия

Тъй като повечето клетки са твърде малки, за да се видят с просто око, изследването на клетките зависи до голяма степен от използването на микроскопи. Всъщност самото откритие на клетките произлиза от развитието на микроскопа: Робърт Хук за първи път въвежда термина �ll” след наблюденията си на парче корк с обикновен светлинен микроскоп през 1665 г. (Фигура 1.23). Използвайки микроскоп, който увеличава обектите до около 300 пъти техния действителен размер, Антони ван Льовенхук през 1670-те години успява да наблюдава различни видове клетки, включително сперматозоиди, червени кръвни клетки и бактерии. Предложението за клетъчната теория от Матиас Шлайден и Теодор Шван през 1838 г. може да се разглежда като раждането на съвременната клетъчна биология. Микроскопските изследвания на растителни тъкани от Schleiden и на животински тъкани от Schwann доведоха до едно и също заключение: Всички организми са съставени от клетки. Малко след това се разбра, че клетките не се образуват de novo но възникват само от деленето на вече съществуващи клетки. Така клетката постигна сегашното си признание като основна единица на всички живи организми поради наблюдения, направени със светлинния микроскоп.

Фигура 1.23

Клетъчната структура на корка. Репродукция на рисунката на Робърт Хук на тънък резен корк, изследван със светлинен микроскоп. �lls”, които Хук наблюдава, всъщност са само клетъчните стени, останали от клетки, които отдавна са били (повече. )

Светлинният микроскоп остава основен инструмент на клетъчните биолози, с технически подобрения, позволяващи визуализирането на постоянно нарастващи детайли на клетъчната структура. Съвременните светлинни микроскопи са в състояние да увеличават обекти до около хиляда пъти. Тъй като повечето клетки са с диаметър между 1 и 100 μm, те могат да бъдат наблюдавани чрез светлинна микроскопия, както и някои от по-големите субклетъчни органели, като ядра, хлоропласти и митохондрии. Светлинният микроскоп обаче не е достатъчно мощен, за да разкрие фини детайли от клетъчната структура, за което резолюция—Способността на микроскопа да различава обекти, разделени на малки разстояния—е дори по-важна от увеличението. Изображенията могат да се увеличават колкото желаете (например чрез прожекция върху голям екран), но такова увеличение не повишава нивото на детайлност, което може да се наблюдава.

Границата на разделителна способност на светлинния микроскоп е приблизително 0,2 μm. Два обекта, разделени на по-малко от това разстояние, изглеждат като едно изображение, вместо да се различават един от друг. Това теоретично ограничение на светлинната микроскопия се определя от два фактора—дължината на вълната (λ) на видимата светлина и силата на събиране на светлина на лещата на микроскопа (числова апертура, NA)—съгласно следното уравнение:

Дължината на вълната на видимата светлина е от 0,4 до 0,7 μm, така че стойността на λ е фиксирана на приблизително 0,5 μm за светлинния микроскоп. Числовата апертура може да се представи като размерът на светлинния конус, който влиза в лещата на микроскопа след преминаване през образеца (Фигура 1.24). То се дава от уравнението

Фигура 1.24

Числова апертура. Светлината се фокусира върху образеца от кондензаторната леща и след това се събира от обективната леща на микроскопа. Числовата апертура се определя от ъгъла на светлинния конус, влизащ в лещата на обектива (α) и от (повече. )

Следователно теоретичната граница на разделителна способност на светлинния микроскоп може да се изчисли, както следва:

Микроскопите, способни да постигнат това ниво на разделителна способност, са направени още в края на деветнадесети век, не могат да се очакват по-нататъшни подобрения в този аспект на светлинната микроскопия.

Няколко различни вида светлинна микроскопия се използват рутинно за изследване на различни аспекти на клетъчната структура. Най-простият е микроскопия в светло поле, при който светлината преминава директно през клетката и способността за разграничаване на различни части на клетката зависи от контраста, произтичащ от поглъщането на видимата светлина от клетъчните компоненти. В много случаи клетките се оцветяват с багрила, които реагират с протеини или нуклеинови киселини, за да подобрят контраста между различните части на клетката. Преди оцветяването, пробите обикновено се третират с фиксатори (като алкохол, оцетна киселина или формалдехид), за да се стабилизират и запазят техните структури. Изследването на фиксирани и оцветени тъкани чрез микроскопия в светло поле е стандартният подход за анализ на тъканни проби в хистологични лаборатории (Фигура 1.25). Такива процедури за оцветяване обаче убиват клетките и следователно не са подходящи за много експерименти, при които се желае наблюдението на живи клетки.

Фигура 1.25

Микрография в светло поле на оцветена тъкан. Напречен разрез на космения фоликул в човешката кожа, оцветен с хематоксилин и еозин. (G. W. Willis/ Биологична фотослужба.)

Без оцветяване, директното преминаване на светлината не осигурява достатъчен контраст за разграничаване на много части от клетката, ограничавайки полезността на микроскопията на светло поле. Въпреки това, оптичните вариации на светлинния микроскоп могат да се използват за подобряване на контраста между светлинните вълни, преминаващи през области на клетката с различна плътност. Двата най-често срещани метода за визуализиране на живи клетки са фазово-контрастна микроскопия и диференциална интерференционно-контрастна микроскопия (Фигура 1.26). И двата вида микроскопия използват оптични системи, които преобразуват вариациите в плътността или дебелината между различните части на клетката в разлики в контраста, които могат да се видят в крайното изображение. При микроскопията с ярко поле прозрачните структури (като ядрото) имат малък контраст, тъй като поглъщат слабо светлината. Въпреки това, светлината се забавя, докато преминава през тези структури, така че нейната фаза се променя в сравнение със светлината, която е преминала през заобикалящата цитоплазма. Фазово-контрастната и диференциалната интерференционно-контрастна микроскопия преобразуват тези разлики във фазата в разлики в контраста, като по този начин се получават подобрени изображения на живи, неоцветени клетки.

Фигура 1.26

Микроскопско наблюдение на живи клетки. Микрофотографии на клетки на човешката буза, получени с (A) светло поле, (B) фазов контраст и (C) диференциална интерференционно-контрастна микроскопия. (С любезното съдействие на Mort Abramowitz, Olympus America, Inc.)

Силата на светлинния микроскоп е значително разширена чрез използването на видеокамери и компютри за анализ и обработка на изображения. Такива електронни системи за обработка на изображения могат значително да подобрят контраста на изображенията, получени със светлинния микроскоп, позволявайки визуализирането на малки обекти, които иначе не биха могли да бъдат открити. Например, видео-усилена диференциална интерференционно-контрастна микроскопия позволява визуализиране на движението на органели по протежение на микротубулите, които са цитоскелетни протеинови филаменти с диаметър само 0,025 μm (Фигура 1.27). Това подобрение обаче не преодолява теоретичната граница на разделителна способност на светлинния микроскоп, приблизително 0,2 μm. По този начин, въпреки че подобряването на видеото позволява визуализирането на микротубулите, микротубулите изглеждат като замъглени изображения с диаметър най-малко 0,2 μm и отделна микротубула не може да бъде разграничена от пакет от съседни структури.

Фигура 1.27

Подобрена с видео диференциална интерференционно-контрастна микроскопия. Електронната обработка на изображения позволява визуализирането на единични микротубули. (С любезното съдействие на E. D. Salmon, Университет на Северна Каролина, Чапъл Хил.)

Светлинната микроскопия е доведена до нивото на молекулярния анализ чрез методи за маркиране на специфични молекули, така че да могат да бъдат визуализирани в клетките. Специфични гени или РНК транскрипти могат да бъдат открити чрез хибридизация с нуклеинови киселинни сонди с комплементарна последователност, а протеините могат да бъдат открити с помощта на подходящи антитела (вж. Глава 3). Както сондите за нуклеинова киселина, така и антителата могат да бъдат маркирани с различни етикети, които позволяват визуализирането им в светлинния микроскоп, което прави възможно определянето на местоположението на специфични молекули в отделните клетки.

Флуоресцентната микроскопия е широко използван и много чувствителен метод за изследване на вътреклетъчното разпределение на молекулите (Фигура 1.28). Флуоресцентно багрило се използва за маркиране на молекулата, представляваща интерес, в фиксирани или живи клетки. Флуоресцентното багрило е молекула, която абсорбира светлина при една дължина на вълната и излъчва светлина при втора дължина на вълната. Тази флуоресценция се открива чрез осветяване на образеца с дължина на вълната на светлината, която възбужда флуоресцентното багрило и след това чрез използване на подходящи филтри за откриване на специфичната дължина на вълната на светлината, която багрилото излъчва. Флуоресцентната микроскопия може да се използва за изследване на различни молекули в клетките. Едно често приложение е да се маркират антитела, насочени срещу специфичен протеин, с флуоресцентни багрила, така че да може да се определи вътреклетъчното разпределение на протеина. Протеините в живите клетки могат да бъдат визуализирани с помощта на зелен флуоресцентен протеин (GFP) на медузи като флуоресцентен етикет. GFP може да бъде слят с широк спектър от протеини, като се използват стандартни методи за рекомбинантна ДНК, и GFP-маркираният протеин може след това да бъде въведен в клетките и открит чрез флуоресцентна микроскопия.

Фигура 1.28

Флуоресцентна микроскопия. (A) Светлината преминава през възбуждащ филтър, за да избере светлина с дължината на вълната (например синьо), която възбужда флуоресцентното багрило. След това дихроично огледало отклонява възбуждащата светлина надолу към образеца. Излъчената флуоресцентна светлина (още.)

Конфокална микроскопия комбинира флуоресцентна микроскопия с електронен анализ на изображения за получаване на триизмерни изображения. Малка светлинна точка, обикновено доставяна от лазер, се фокусира върху образеца на определена дълбочина. Излъчената флуоресцентна светлина след това се събира с помощта на детектор, като видеокамера. Преди излъчената светлина да достигне до детектора обаче, тя трябва да премине през отвор за точкова дупка (наречен конфокална апертура), поставен точно в точката, където светлината, излъчвана от избраната дълбочина на образеца, стига до фокуса (Фигура 1.29). Следователно само светлината, излъчвана от равнината на фокусиране, може да достигне до детектора. Сканирането през образеца генерира двуизмерно изображение на равнината на фокусиране, много по-рязко изображение от това, получено със стандартна флуоресцентна микроскопия (Фигура 1.30). Освен това серия от изображения, получени на различни дълбочини, може да се използва за реконструкция на триизмерно изображение на пробата.

Фигура 1.29

Конфокална микроскопия. Точкова светлина се фокусира върху образеца на определена дълбочина, а излъчваната флуоресцентна светлина се събира от детектор. Преди да достигне до детектора, флуоресцентната светлина, излъчвана от пробата, трябва да премине през конфокална (повече.)

Фигура 1.30

Конфокална микрография на миши ембрионални клетки. Ядрата са оцветени в червено, а актиновите нишки, лежащи в основата на плазмената мембрана, са оцветени в зелено. (С любезното съдействие на Дейвид Албертини, Медицински факултет на университета Tufts.)

Двуфотонна възбуждаща микроскопия е алтернатива на конфокалната микроскопия, която може да се приложи към живи клетки. Образецът се осветява със светлина с дължина на вълната, така че възбуждането на флуоресцентното багрило изисква едновременното поглъщане на два фотона (Фигура 1.31). Вероятността два фотона едновременно да възбуждат флуоресцентното багрило е значима само в точката в образеца, върху която е фокусиран входният лазерен лъч, така че флуоресценцията се излъчва само от равнината на фокуса на входната светлина. Това силно локализирано възбуждане автоматично осигурява триизмерна разделителна способност, без необходимост от преминаване на излъчваната светлина през отвор на точков отвор, както при конфокалната микроскопия. Освен това, локализирането на възбуждането минимизира увреждането на пробата, позволявайки триизмерно изобразяване на живи клетки.

Фигура 1.31

Двуфотонна възбуждаща микроскопия. За възбуждане на флуоресцентното багрило е необходимо едновременно поглъщане на два фотона. Това се случва само в точката в образеца, върху която е фокусирана входната светлина, така че флуоресцентната светлина се излъчва само от избрания (повече.)


Човешки сърдечни микроваскуларни ендотелни клетки (HCMEC)

Първични човешки сърдечни микроваскуларни ендотелни клетки, изолирани от сърдечни вентрикули от един донор.

Изпратете заявка за оферта до нашия екип по продажбите, за да получите персонализирана оферта за продуктите във вашата количка. Като алтернатива, за информация за цени и поръчки, моля, свържете се с нашия местен дистрибутор за вашия регион:


Характеристики

Нямаше фамилна анамнеза за рак на гърдата.

Клетките са слабо диференцирани.

Клетките са отрицателни за експресия на Her2-neu и за експресия на р53.

HCC1806 е положителен за специфичния за епителните клетки маркер Епителен гликопротеин 2 (EGP2) и за цитокератин 19.

Клетките са хомозиготни за делеции в гена FHIT при 3p14.2.

Работа с информация

  1. Проверете всички контейнери за течове или счупвания.
  2. Извадете замразените клетки от опаковката със сух лед и незабавно поставете клетките при температура под -130°C, за предпочитане в пара на течен азот, до готовност за употреба.

Процедура на работа За да осигурите най-високо ниво на жизнеспособност, размразете флакона и започнете културата възможно най-скоро след получаване. Ако при пристигането е необходимо продължително съхранение на замразената култура, тя трябва да се съхранява във фаза на течен азот, а не при -70°C. Съхранението при -70°C ще доведе до загуба на жизнеспособност.

  1. Размразете флакона чрез леко разбъркване във водна баня с температура 37°C. За да намалите възможността от замърсяване, дръжте О-пръстена и капачката далеч от водата. Размразяването трябва да е бързо (приблизително 2 минути).
  2. Извадете флакона от водната баня веднага щом съдържанието се размрази и обеззаразете чрез потапяне или пръскане със 70% етанол. Всички операции от този момент нататък трябва да се извършват при строги асептични условия.
  3. Прехвърлете съдържанието на флакона в колба с тъканна култура от 75 cm 2 и разредете с препоръчителната пълна културална среда (вижте специфичната информация за партидата за препоръчителното съотношение на разреждане). Важно е да се избягва прекомерната алкалност на средата по време на възстановяването на клетките. Предполага се, че преди добавянето на съдържанието на флакона, съдът за култура, съдържащ пълната растежна среда, се постави в инкубатора за най-малко 15 минути, за да позволи на средата да достигне нормалното си рН (7,0 до 7,6).
  4. Инкубирайте културата при 37°C в подходящ инкубатор. 5% CO2 във въздушна атмосфера се препоръчва, ако използвате средата, описана в този лист на продукта.

Забележка: Ако е желателно криопротективният агент да бъде отстранен незабавно или да се получи по-концентрирана клетъчна суспензия, центрофугирайте клетъчната суспензия при приблизително 125 x g за 5 до 10 минути. Изхвърлете супернатантата и ресуспендирайте клетките с прясна среда за растеж при съотношението на разреждане, препоръчано в специфичната информация за партидата.

Процедура на субкултивиране. Използваните в този протокол обеми са за колба от 75 cm 2 пропорционално намаляват или увеличават количеството на дисоциационната среда за съдовете за култура с други размери.

  1. Отстранете и изхвърлете хранителната среда.
  2. Изплакнете за кратко клетъчния слой с 0,25% (w/v) трипсин-0,53 mM разтвор на EDTA, за да премахнете всички следи от серум, който съдържа инхибитор на трипсина.
  3. Добавете 2,0 до 3,0 mL разтвор на трипсин-EDTA в колба и наблюдавайте клетките под обърнат микроскоп, докато клетъчният слой се диспергира (обикновено в рамките на 5 до 15 минути).

Спецификации за контрол на качеството

История

Правни откази от отговорност

Продуктът се предоставя „КАКТО Е“ и жизнеспособността на продуктите ATCC ® е гарантирана за 30 дни от датата на изпращане, при условие че клиентът е съхранявал и боравил с продукта съгласно информацията, включена в информационния лист за продукта, уебсайта и Сертификат за анализ. За живи култури ATCC изброява формулировката на средата и реагентите, за които е установено, че са ефективни за продукта. Докато други неуточнени среди и реагенти също могат да доведат до задоволителни резултати, промяната в ATCC и/или препоръчаните от вложителя протоколи може да повлияе на възстановяването, растежа и/или функцията на продукта. Ако се използва формулировка или реагент на алтернативна среда, ATCC гаранцията за жизнеспособност вече не е валидна. Освен ако изрично е посочено тук, не се предоставят никакви други гаранции от какъвто и да е вид, изрични или подразбиращи се, включително, но не само, всякакви подразбиращи се гаранции за продаваемост, годност за конкретна цел, производство в съответствие със стандартите на cGMP, типичност, безопасност, точност , и/или ненарушение.

Този продукт е предназначен само за лабораторни изследвания. Той не е предназначен за никаква животинска или човешка терапевтична употреба, консумация от хора или животни или каквато и да е диагностична употреба. Всяка предложена търговска употреба е забранена без лиценз от ATCC.

Въпреки че ATCC полага разумни усилия, за да включи точна и актуална информация в този продуктов лист, ATCC не дава никакви гаранции или декларации относно неговата точност. Цитати от научна литература и патенти са предоставени само за информационни цели. ATCC не гарантира, че такава информация е потвърдена като точна или пълна и клиентът носи единствената отговорност да потвърди точността и пълнотата на всяка такава информация.

Този продукт се изпраща при условие, че клиентът носи отговорност и поема всички рискове и отговорности във връзка с получаването, манипулирането, съхранението, изхвърлянето и използването на продукта ATCC, включително, без ограничение, вземането на всички подходящи предпазни мерки за безопасност и работа, за да се сведе до минимум здравето или риск за околната среда. As a condition of receiving the material, the customer agrees that any activity undertaken with the ATCC product and any progeny or modifications will be conducted in compliance with all applicable laws, regulations, and guidelines. This product is provided 'AS IS' with no representations or warranties whatsoever except as expressly set forth herein and in no event shall ATCC, its parents, subsidiaries, directors, officers, agents, employees, assigns, successors, and affiliates be liable for indirect, special, incidental, or consequential damages of any kind in connection with or arising out of the customer's use of the product. While reasonable effort is made to ensure authenticity and reliability of materials on deposit, ATCC is not liable for damages arising from the misidentification or misrepresentation of such materials.

Please see the material transfer agreement (MTA) for further details regarding the use of this product. The MTA is available at www.atcc.org.


Инструкции

Co-culture Experiments with Lonza's Small Airway Epithelial Cells and SAGM TM BulletKit TM Media

Data Courtesy of Furukawa, et al. Lonza's SAEC cells were co-cultured with primary normal mammary epithelial cells, breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 in Lonza's SAGM TM BulletKit TM Growth Media. Breast cancer cell lines showed differences in morphology and proliferation rates in the presence of small airway epithelial cells. The image above shows phase contrast imaging with a fluorescent (red) overlay of MCF-7 cell line. MCF-7 cell lines survived as tight clusters in SAGM TM Media. When co-cultured with Lonza's primary SAECs, MCF-7 cells demonstrated enhanced growth all the while staying clustered.

Subscribe to our eNewsletter

Keep up to speed on the latest scientific developments, events, tips and tools from Lonza.

Interested in our Webinars?

Need a break from your daily routine? Grab a coffee and check out our free webinars.

Need a Quote or Any Support?

Are Lonza's primary cells and media applicable to your project? Do you need a quote or any help? Contact us and a local representative will get back to you.


Методи

Growth Requirements

The culture media used for cell cultures are generally quite complex, and culture condition widely varies for each cell type. However, media generally include amino acids, vitamins, salts (maintain osmotic pressure), glucose, a bicarbonate buffer system (maintains a pH between 7.2 and 7.4), growth factors, hormones, O2 и CO2. To obtain best growth, addition of a small amount of blood serum is usually necessary, and several antibiotics, like penicillin and streptomycin are added to prevent bacterial contamination.

Temperature varies on the type of host cell. Most mammalian cells are maintained at 37 o C for optimal growth, while cells derived from cold-blooded animals tolerate a wider temperature range (i.e. 15 o C to 26 o C). Actively growing cells of log phage should be used which divide rapidly during culture.

Process to obtain primary cell culture

Primary cell cultures are prepared from fresh tissues. Pieces of tissues from the organ are removed aseptically which are usually minced with a sharp sterile razor and dissociated by proteolytic enzymes (such as trypsin) that break apart the intercellular cement. The obtained cell suspension is then washed with a physiological buffer (to remove the proteolytic enzymes used). The cell suspension is spread out on the bottom of a flat surface, such as a bottle or a Petri dish. This thin layer of cells adhering to the glass or plastic dish is overlaid with a suitable culture medium and is incubated at a suitable temperature.

Aseptic техники

Bacterial infections, like Mycoplasma and fungal infections, commonly occur in cell culture creating a problem to identify and eliminate. Thus, all cell culture work is done in a sterile environment with proper aseptic techniques. Work should be done in laminar flow with the constant unidirectional flow of HEPA filtered air over the work area. All the material, solutions and the whole atmosphere should be of contamination-free.

Cryopreservation

If a surplus of cells is available from sub-culturing, they should be treated with the appropriate protective agent (e.g., DMSO or glycerol) and stored at temperatures below –130°C until they are needed. This stores cell stocks and prevents original cell from being lost due to unexpected equipment failure or biological contaminations. It also prevents finite cells from reaching senescense and minimizes risks of changes in long term cultures.

When thawing the cells, the frozen tube of cells is warmed quickly in warm water, rinsed with medium and serum and then added into culture containers once suspended in the appropriate media.


What Is the Function of the Cheek Cell?

A cheek cell, an epithelial cell found in the tissue on the inside lining of the mouth, continually secretes mucus to maintains a moist environment in the mouth. Together with salivary glands that secrete saliva, the cheek cells supply enough moisture in the mouth for enzymes to thrive. This moisture softens food, assists in swallowing and starts digestion.

The epithelial cells in the lining of the mouth are referred to as basal mucosa and divide roughly every 24 hours. They can easily be obtained through a simple swab or a mouth rinse. The cheek cell is very simple, but it contains the entire genetic makeup of the person's body. For this reason, cheek cells are frequently used to establish paternity and other investigations involving DNA. More recently, researchers have discovered that the cheek cell can be used to measure a person's likelihood of having high blood pressure.

A human cheek cell is thin, flat and irregularly shaped and has a large nucleus that contains the DNA. Its plasma membrane helps the cell to maintain suitable temperature while giving it its shape. Since it is selectively permeable, it only allows certain molecules into and out of the cell. Its cytoplasm contains water that dissolves nutrients and enzymes.


Basic equipment and reagents required for cell culture

To conduct research requiring cell culture work and to perform fundamental cell culture protocols, there are several key pieces of equipment and some basic reagents that are required, summarized in Tables 1 and 2.

Маса 1: Basic equipment required for cell culture. 3 , 4 , 5 The images were created with BioRender.com.

Table 2: The basic reagents needed for cell culture. 2 , 5

See section below on media for your cells.

Phosphate-buffered saline (PBS) used for washing cells.

An enzyme used to detach adherent cells from culture vessels for culturing, such as trypsin.

An agent that reduces the freezing point of media and slows the cooling rate to reduce the risk of ice crystal formation which can damage cells and cause cell death. Dimethylsulfoxide (DMSO) is most commonly used.



It is also important to have access to deionized and distilled water as well as ice. The nature of the experiments to be performed will inform the reagents that will need to be acquired.


Current Functions

1) Tissue Procurement

Obtain nasal tissues and tracheo-bronchiolar segments from normal, CF, and disease control humans as sources of airway epithelial cells (hAE). The MLI TPC then utilizes the harvested hAE cells for culture, for ex vivo experiments, for RNA and proteins representative of in vivo conditions, and for на място hybridization and immunohistochemistry. As a service to the greater CF research community (Function 6), the MLI TPC accepts tissues from other institutions through longstanding sources including local and distant outpatient surgical centers such as the UNC Lung Transplant Program, Carolina Donor Services, International Institute for the Advancement of Medicine (IIAM, Edison, NJ), and the National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA). The MLI TPC also accepts tissues from highly motivated donors nationally and internationally. Ongoing sources of CF tissues from independently recruited lung transplant programs include Loyola University, Maywood IL, Vanderbilt University, Medical College of Wisconsin, Israel, and Duke University Medical Center. Furthermore, in collaboration with the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT) and NDRI, explanted CF lungs from multiple lung transplant centers are sent to UNC for processing.

2) Airway Epithelial Cell Isolation and Culture

а) Isolate epithelial cells from excised human nasal tissues, including endosinus mucosa, and cartilaginous bronchi of human lungs for distribution to investigators.

б) Prepare and maintain primary epithelial cell cultures, such as primary alveolar epithelial cells, microvascular endothelial cells and/or fibroblasts from the tissues noted above. The Core provides support for the preparation of well-differentiated airway epithelial cultures from passaged, or cryopreserved and thawed human cells, on permeable substrates.

° С) Optimize and standardize epithelial culture conditions to replicate the gene expression, morphological differentiation, and physiologic functions of airways.

The MLI TPC also provides passage 1 airway epithelial cells, like primary cells, they too are suitable for producing well-differentiated cultures on porous supports. Representative sections of well-differentiated nasal and bronchial airway epithelial cell cultures are shown in Figure 1.

Фигура 1. Representative photomicrographs of well-differentiated passage 1 nasal (A) and bronchial (B) human airway epithelial cells grown at an air-liquid interface for 14-21 days. OsO4 fixation, epon embedding and Richardsons stain, both panels at the same magnification, original magnification=1000x.

Routine MLI TPC procedures have significantly improved our ability to study differentiation-dependent functions (Figure 2) and have also increased the number and area of well-differentiated cultures produced from each sample. Possessing the ability to store primary cells at differing stages of maturity from the same patient sample allows repeat experiments with the same specimen. Additionally, we can perform simultaneous experiments with replicate cultures derived from multiple patients.

Фигура 2. Demonstration of rotational mucus transport in well-differentiated cultures. A) 1 mm fluorescent microspheres were added to the culture surface and were propelled by the coordinated beating of cilia. A 5-second time-lapse exposure is shown. B) Linear velocities of the particles were measured and plotted as a function of distance from the center of rotation.

The in-house production of BEGM and ALI media has also resulted in significant cost savings and a deeper understanding of cell culture among staff. We are focused on producing cultures that accurately mirror in vivo gene expression, morphology, and physiology and which reproduce known differences between CF and non-CF individuals in vivo. Supplying large numbers of cultures, and large batches of media, in response to changing investigator needs is one of the major MLI TPC functions.

3) Collect Airway Surface Liquid (ASL) from in vivo и инвитро Образци

Critical testing of current advances in CF pathogenesis requires direct measurement of the chemical composition of human ASL. We have consistently collected and distributed in vivo airway mucus secretions for the study of biochemical composition, biophysical properties and as the source of the supernatant of mucopurulent material (SMM) from CF lungs. Additionally, ASL from well-differentiated cultures is used to stimulate air-liquid interface (ALI) cultures and serves as the basis for key experiments related to novel concepts in CF. The MLI TPC provides luminal contents of CF lungs explanted during transplant or removed at autopsy and harvests ASL from инвитро източници.

4) Genetic Manipulation of Cell Cultures

Фигура 3. Lentiviral vector genetic manipulation of hTBE cells. A) hTBE cells were sham-transduced (control) or infected with lentiviral vectors expressing a fused GFP/Blasticidin resistance protein (GFP/BSD) or red fluorescent protein linked to GFP/BSD by an internal ribosome entry site (RFP IRES), conventional epifluorescence microscopy 5 days following infection. B) RFP IRES-infected cells were trypsinized from plastic dishes, passaged to air-liquid interface cultures and allowed to differentiate for 35 days, X-Z plane confocal image. Note that the GFP/BSD fusion protein is apparently excluded from the nucleus while the RFP distributes equally. Basal cell expression is apparently lower from the CMV promoter, and alternative promoters enabling uniform expression are being tested.

Use adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus (see Figure 3) and retrovirus vectors in combination with chemical treatment as necessary, to assist in the production of genetically manipulated, well-differentiated primary airway epithelial cell cultures.

5) Create and Characterize Novel Cell Lines

Use recent advances in cell immortalization technology to create new cell lines and characterize their biochemical properties, morphology and electrophysiologic function. The goal of the TPC is to create new and better immortalized cells retaining a greater capacity to recapitulate normal airway epithelial function. We have used retroviral transduction to serially introduce SV40 ER or HPV E6/E7 and hTERT into non-CF and CF cells. Their growth potential, morphology, biochemical features and electrophysiologic properties are studied using typical methods. Our ongoing observations have revealed that cells immortalized by SV40 ER or HPV E6/E7 and hTERT, when grown at an air-liquid-interface, are not optimal for CF-related investigation. This has led to novel studies using Bmi-1 oncogene to create superior cell lines (AJP 2009). Six novel cell lines using the Bmi-1 oncogene (3 normal and 3 deltaF508 homozygous CF) have been characterized (see Figure 4).

6) Translation of Technology and Reagents to the Greater CF Research Community

Our Core strongly observes the philosophy of developing non-proprietary technology and supporting its widespread translation. By providing material and consultative support, the MLI TPC allows others to develop or improve upon their own in-house cell culture capabilities. This involves the shipment of cells or media, hosting visitors for training, and publication of methods specifically related to improvements in human airway cell culture. In addition to hosting periodic training sessions for visitors from the US, England, Ireland, Switzerland, Canada, France, and Israel for the purpose of technology transfer, the MLI TPC consults with distant users as they encounter experimental difficulties related to their cell model work. The MLI TPC’s standing as a recharge center has allowed for a more accessible and efficient user experience. We are able to provide immortal cell lines at minimal expense, custom cell line creation for those who have sent us tissue specimens using CRC technology, and offer customized media based on manager approval.

Some of our latest updated methods have been published as a part of the Methods in Molecular Biology (MIMB) series, with the title “Epithelial Cell Culture Protocols.” The MLI TPC strives to meet the needs of academic, UNC, and commercial interests, when possible. Consultative support including advice, protocols, and more can be found on this site. If there are any requests outside of the information provided, feel free to contact the Laboratory Manager with the link provided at the top of the page.

7) New Initiatives Based on Investigator Needs

Фигура 4. Robotic two plate TECC24 device that will facilitate quality control and experimental electrophysiologic testing. This device will increase our capacity to test cells from the current six, to 36 specimens per day (in quadruplicate wells). This piece of equipment is integral in improving the efficiency of our quality control testing process. The device also requires fewer cells from each specimen for analysis, which is ideal for the conservation of our resources.

Representative Ussing chamber results from UNCN1-3T (normal) and UNCCF1-3T (CF) cell lines. Note the absence of a forskolin (Fsk) response in the 4 replicate CF cell tracings, Amil = amiloride.

The TPC is responsive to the changing needs of UNC MLI investigators and provides material support for phasic motion and cyclic compressive stress studies, chambers for exposure to hypoxic conditions, mouse airway epithelial cell cultures, human lung vascular endothelial cell cultures and human alveolar epithelial cell cultures. The TPC has applied new methods enabling routine provision of well-differentiated tracheal epithelial cell cultures from normal mice as well as cultures from genetically manipulated mice, including CF mice, mice over-expressing the epithlial Na + channel, Coxsackie adenovirus receptor expressing mice, caveolin knockout mice and other genetically unique strains.