Информация

Защо моето ДНК е под стълбата?

Защо моето ДНК е под стълбата?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Проведох градиентна PCR... и лента 6 след стълбата очевидно е най-ярката. Но всички ленти се появяват под стълбата. Какво означава това? Извлича се mDNA, която е заредена.

Благодаря ви предварително!


Под стълбата означава димер за грунд. Нямате продукт.


Какво е ДНК?

Дезоксирибонуклеиновата киселина (ДНК) е химикал, който се намира в ядрото на клетките и носи ‘инструкциите’ за развитието и функционирането на живите организми.

Често се сравнява с набор от чертежи, тъй като съдържа инструкциите, необходими за изграждане на клетки.

Тези инструкции са разделени на сегменти по веригата на ДНК и се наричат ​​гени.

Гените са ДНК последователност, която кодира производството на протеин и контролира наследствени характеристики като цвят на очите или поведение на личността.

Протеините определят типа и функцията на клетката, така че клетката знае дали е кожна клетка, кръвна клетка, костна клетка и т.н., и как да изпълнява съответните задачи.

Други ДНК последователности са отговорни за структурни цели или участват в регулирането и използването на генетична информация.

Структура на ДНК

Структурата на ДНК може да се сравни със стълба.

Той има редуващ се химически фосфат и захарен гръбнак, което прави ‘страните’ на стълбата.

(Дезоксирибозата е името на захарта, намираща се в гръбнака на ДНК.)

Между двете страни на този захарно-фосфатен гръбнак има четири азотни бази: аденин (A), тимин (T), цитозин (C) и гуанин (G).

(Групиране като това от фосфат, захар и основа съставлява субединица от ДНК, наречена нуклеотид.)

Тези основи съставляват ‘рънгите’ на стълбата и са прикрепени към гръбнака, където се намират молекулите дезоксирибоза (захар).

Химическите бази са свързани помежду си чрез водородни връзки, но базите могат да се свържат само със специфичен основен партньор – аденин и тимин се свързват помежду си, а цитозин и гуанин се свързват един с друг.

Подреждането на тези основи е много важно, тъй като това определя какъв ще бъде организмът – растение, животно или гъбичка.

Това се нарича генетично кодиране. Например, едната страна на ДНК може да има генетичен код AAATTTCCCGGGATC. Неговата допълваща страна тогава би трябвало да бъде TTAAAGGGCCCTAG.

Въпреки че формата на ДНК често се описва като стълба, тя не е права стълба.

Тя е усукана надясно, което прави формата на ДНК молекулата дясна двойна спирала. Тази форма позволява голямо количество генетична информация да бъде ‘напълнена’ в много малко пространство.

Всъщност, ако подредите всяка молекула ДНК в една клетка от край до край, веригата ще бъде дълга шест фута.

ДНК се репликира

Преди една клетка да може да се раздели и да създаде нова клетка, тя първо трябва да дублира своята ДНК.

Този процес се нарича репликация на ДНК.

Когато дойде време за репликация, водородните връзки, държащи базовите двойки заедно, се разкъсват, позволявайки на двете ДНК вериги да се развият и разделят.

Специфичното сдвояване на бази осигурява начин на ДНК да прави точни копия на себе си. Всяка половина от оригиналната ДНК все още има основа, прикрепена към нейния захарно-фосфатен гръбнак.

Нова верига на ДНК се произвежда от ензим, наречен ДНК полимераза. Той чете оригиналната нишка и съпоставя допълнителни бази с оригиналната нишка.

(Захарно-фосфатният гръбнак идва с новите основи.)

Нови вериги се прикрепят към двете страни на оригиналната ДНК, правейки две идентични ДНК двойни спирали, съставени от една оригинална и една нова верига. Моля, имайте предвид, че горното обяснение за репликацията на ДНК е силно опростено.

Как се използва ДНК

Всички живи същества – растения, животни и хора – предават ДНК от родителите на потомството под формата на хромозоми.

При хората 23 хромозоми се предават от майката и 23 хромозоми се предават от бащата, давайки на детето 46 хромозоми.

Хромозомите носят гени от родителите, но не всички гени на родител се изпращат.

За всяко дете се предават различни набори от гени от родителите, което води до уникална ДНК за всяко дете. Това означава, че въпреки че генетичният код за всички човешки същества е 99,9% идентичен, никой няма точно същия ДНК код, освен в случая на истински еднояйчни близнаци.

Знаейки това, ДНК може да се използва за идентифициране на хора в различни ситуации. Тази област е известна като криминалистика.

ДНК често се използва за разкриване на престъпления чрез идентифициране на жертви и заподозрени, като в същото време се изключват невинни хора като възможни заподозрени за престъпление.

Използва се също за доказване или опровергаване на семейни отношения, идентифициране на изчезнали лица и идентифициране на жертвите на катастрофи, които вече не могат да бъдат физически идентифицирани.

И тъй като ДНК може да бъде открита в различни човешки тъкани и течности като коса, урина, кръв, сперма, кожни клетки, кости, зъби и слюнка, тя значително помага при идентифицирането, когато други методи, като пръстови отпечатъци и структура на зъбите, вече не са използваеми.

Медицинската област също използва ДНК. Сега, когато лекарите поне частично разбират как функционира ДНК, съвременната медицина е постигнала напредък в идентифицирането на болести и намирането на лекове.

Много заболявания, като кистозната фиброза, са наследствени заболявания, което означава, че се предават от родител на потомство.

Разглеждайки ДНК на дадено лице, лекарите могат да определят какво е заболяването или колко податливи са дадено лице или неговите деца да имат определено заболяване. Лекарите също изследват как клетките с увредена ДНК се размножават, за да им помогнат да намерят лекове или лечения за заболявания като рак и тумори.

Но познанието за ДНК не се използва само при хората. Учените по храните използват ДНК информация, за да подобрят културите и да разработят нови източници на храна.

Развъдчиците на растения избират растения, които дават високи добиви от храна, устойчиви са на вредители и понасят стреса от околната среда по-добре от подобни сортове растения.

Това е особено важно в райони с лоши условия за отглеждане и/или районът има голямо население за хранене. Въпреки това, нараства дебатът дали тези генетично модифицирани източници на храна са безопасни и здравословни за консумация от човека.


Защо трябва да изберете ДНК стълби, които се доставят при условия на околната среда

Предимството да бъдеш „зелен“ на работното място е, че може да е от полза за всички ни. Въпреки това, работата в лабораторията може да затрудни екологосъобразността. Въпреки че елиминирането на отпадъците в експериментите с молекулярна биология може да не е възможно или практично, можете значително да намалите опаковъчните и транспортните материали на различни етапи от работния процес на молекулярната биология.

Сега можете да помогнете за минимизиране на отпадъците, като същевременно поддържате същите страхотни резултати във вашите експерименти с електрофореза на нуклеинови киселини. Тестването показа, че качеството на продукта и дългосрочната стабилност не се влияят от околното транспортиране на ДНК стълби на Thermo Scientific. Отидете в атмосфера днес и:


ДНК ленти, видими без UV излагане

Ако това е електрофореза с агарозен гел, това не е вашата ДНК, която виждате, а багрилото от вашата проба. Не се доверявайте на нищо, което не виждате под UV светлина.

не е вярно, бледите червени ивици са нуклеинова киселина, предполагам, че това е EtBr. Рестрикционно разлагане на плазмид от външния му вид?

Можете да видите ДНК над и под ксилен цианола.

Дори в UV виждате етидиевия бромид да се свързва с ДНК, а не самата ДНК.

Това вероятно е ДНК, интеркалирана с етидиев бромид. Имате концентрирана ДНК лента и от своя страна концентрирате кестенявия етидиев бромид в лентата.

Получавам това през цялото време, когато моите PCR се оказват благоприятни :) Ако имате добър усет за стълбата, можете дори да изрежете лентата без UV - аз също съм правил това много пъти. Използваме евтини колони, но с толкова ярки ленти моят добив беше

3-6 микрограма общо (елуиране с

Вероятно виждате излишък от EtBr интеркалиран във вашата ДНК, тъй като това изглежда като стандартен агарозен гел след електрофореза. Позволете ми да позная, PCR или продукти, усвоени с рестрикционни ензими? Единственият сигурен отговор за вашата ДНК е това, което виждате под UV.

В лента 1 виждам бромофенол синьо, а в лента 2 виждам ксилен цианол и оранжеви G багрила. Виждам също две относително стегнати розови ленти над и под лентата с ксилен цианол, съдейки по размера на лентата, бих предположил, че сте използвали твърде много етидиев бромид.

Ако сте въвели етидиев бромид директно във вашата проба, а не след разтопена агароза, тук е вашият проблем, в противен случай мисля, че просто сте добавили твърде много към гела.

Това обаче не би трябвало да е проблем, в зависимост от приложението надолу по веригата, можете да го премахнете от всякакви проби, като извършите екстракция с фенол, последвана от утаяване.

Това изглежда като зареждане на боя, приятел. Това, което виждате, съответства ли на UV изображенията?

Не съм сигурен какво питаш. Но причината да виждате много ДНК е, че има много ДНК.

Какво точно се опитваш да правиш тук? Генотипиране? Ако е така, изпратете ми съобщение и ще ви дам няколко различни протокола. Вашите ленти изглеждат наистина широки и може да не успеете да видите никакви "ленти", само петна, които не са наистина полезни за генотипиране.

20 ug ДНК е безумно количество. Използвам 1 микролитър ДНК разтвор в концентрация по-малка от 100 ng/uL. Трябва да го разредите!

За моите гелове използвам SyberRed вместо EB. Моята рецепта е 2,25 g агароза със 150 mL TAE буфер и 5 микролитра SyberRed на 50 mL буфер. (И така, 15 mL SyberRed.)

Това, което виждате, е вашата зареждаща боя/буфер. Жълтата част трябва да ви помогне да визуализирате как ДНК се движи, така че да не изтича от гела. Когато жълтото се доближи до ръба, е време да спрете!

Синьото представлява багрилото за зареждане и това е мястото, където ще бъде вашата ДНК лента. ДНК всъщност не се вижда без UV светлина. ДНК се появява, като утайка, като белезникав прах и в гела, без никаква боя, ще изглежда бистра.


100bp ДНК стълба:

В 100bp ДНК стълбата най-малкият фрагмент е от 100bp.

Другият фрагмент варира от производителя до производителя. Вижте изображението, дадено по-долу,

В идеалния случай ДНК стълбата от 100 bp съдържа 10 фрагмента от 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp и 1000 bp.

Въпреки това, някои производители предоставят от 100 до 1500 bp.

В идеалния случай концентрацията на всеки ДНК фрагмент е

25ng с изключение на 500bp и 1000bp.

Концентрацията на фрагмента от 500 bp и 1000 bp е 100 ng, следователно може да изглежда по-остър и по-концентриран от други фрагменти.

100bp ДНК стълбата е един от често използваните стандартни маркери за молекулно тегло по време на PCR.

2% концентрация на агарозен гел е идеална за него, въпреки че 2,5% концентрация на гела дава по-остри ДНК ленти (наши собствени наблюдения).


Защо моето ДНК е под стълбата? - Биология

Криминалистите от време на време трябва да реконструират ДНК профила на изчезнал човек от анализ на ДНК профилите на близки роднини. В случая липсва майка на четири деца. Всички деца имат един и същ биологичен баща. Резултатите от анализ на ДНК пръстови отпечатъци с единичен локус сонда за четирите деца и техния баща са показани на фигурата. За съжаление криминалистът забравил да напише етикета на платното с ДНК на бащата.

Въпреки това можете да заключите, че алелите на изчезналата майка са:

Урок

Възстановяване на профила на изчезналата майка
Всеки родител допринася с един набор от алели за всяко дете. Авторадиографът в този случай съдържа ДНК от четири деца и техния баща. Всяко дете ще споделя една лента с майката и една с бащата. Можете да използвате процеса на елиминиране, за да определите коя лента съдържа ДНК на бащата. Тогава знаете, че лентите в децата, които не са споделени с бащата, трябва да са били внесени от изчезналата майка. По този начин можете да използвате процеса на елиминиране, за да възстановите профила на липсващата майка.
Потърсете ленти, които не споделят ленти
Вижте лентите в ленти 2 и 5. Лента 2 съдържа алелите A и B, докато лента 5 съдържа алели C и D. Тъй като тези ленти нямат общи ленти, нито една лента не може да съдържа ДНК на бащата. Не забравяйте, че всяко дете ще споделя една лента с бащата и една с майката, чието ДНК не е на този авторадиограф.
Вижте лентите в ленти 3 и 4. Отново няма съвпадащи алели, така че тези ленти не съдържат ДНК на бащата. Имайте предвид, че братята и сестрите не наследяват непременно едни и същи алели от родителите си и обикновено имат различни ДНК профили един от друг.
Премахване на възможностите за определяне на алелите на бащата и майката

След като са изключени 4 от 5-те ленти, лентата на бащата е лесна за идентифициране. Проверете работата си, като съпоставите лентата на бащата с всяка лента за четирите деца. Отново, една лента от бащата трябва да съответства на поне една лента за всяко дете.

След като идентифицирате алелите, принадлежащи на бащата, определянето на генотипа на майката е лесно - тя има 2 алела, които се намират в техните деца, но не и в профила на бащата.


Диагностично ограничение

Диагностичните обобщения могат да се използват за потвърждаване на грубата структура на плазмида въз основа на предвидените размери и организация на различни характеристики в плазмида. Рестрикционният анализ може също да се използва успешно, дори ако нямате пълната плазмидна последователност. След като имате пречистена плазмидна ДНК, този метод може да бъде направен точно във вашата лаборатория за по-малко от ден. Диагностичните рестрикционни усвоявания се състоят от 2 отделни стъпки: 1) инкубиране на вашата ДНК с рестрикционни ензими, които разцепват ДНК молекулите на специфични места и 2) провеждане на реакцията върху агарозен гел за определяне на относителните размери на получените ДНК фрагменти.

Рестрикционните обобщения обикновено се използват за потвърждаване на наличието на вмъкване в конкретен вектор чрез изрязване на вложката от гръбнака. За да направите това, ще използвате ензими с рестрикционни места, които обграждат вложката. Ще трябва да знаете както приблизителния размер на векторния гръбнак, така и предвидения размер на вложката. Можете да търсите в NCBI за YGOI, за да намерите конкретната референтна последователност, ако е необходимо.

Примерният плазмид вдясно има общ размер от 7,3 kb, включително вмъкване от 1,2 kb. Плазмидът се усвоява с 2 уникални ензима (HindIII и BamHI) и се работи върху агарозен гел. Полученото гел изображение включва стълба от 1 kb (лента 1), която има ленти, вариращи от около 500 bp до 10 kb, като фрагментът от 3,0 kb има повишен интензитет, за да служи като референтна лента. Неразрязаната ДНК (лента 2) показва 3 възможни плазмидни конформации, с отпуснати и изрязани, маркирани със звездички (*). Когато плазмидът се усвоява само с HindIII и BamHI (ленти 4-5), има единична лента от 7,3 kb, представляваща пълния размер на плазмида. Двойният дайджест както с HindIII, така и с BamHI (лента 3) произвежда ленти при 6 kb и 1,2 kb (червена кутия), съответстващи съответно на гръбнака и вмъкването. Резултатите върху гела отговарят на предвидените размери.

Гледайте този видеоклип за бърз преглед на това как да анализирате обобщение с ограничения:


Съдържание

Развитие Редактиране

Въпреки че концепцията за маркери за молекулярно тегло е запазена, техниките на разработка са варирали през годините. Нови изобретения на маркери с молекулно тегло се разпространяват в комплекти, специфични за типа на маркера.

Ранен проблем при разработването на маркери беше постигането на висока разделителна способност по цялата дължина на маркера. [1] В зависимост от условията на гел електрофореза, фрагментите може да са били компресирани, нарушавайки яснотата. За да се справи с този проблем, през 1990 г. е разработен комплект за Southern Blot анализ, осигуряващ първия маркер за комбиниране на целевата ДНК и ДНК на сондата. Тази техника се възползва от логаритмичното разстояние и може да се използва за идентифициране на целеви ленти с дължина над 20 000 нуклеотида. [2]

Редактиране на дизайна

Има два често срещани метода за конструиране на маркер за размер на ДНК с молекулно тегло. [3] Един такъв метод използва техниката на частично лигиране. [3] ДНК лигирането е процесът, чрез който линейните ДНК парчета са свързани помежду си чрез ковалентни връзки по-точно, тези връзки са фосфодиестерни връзки. [4] Тук 100bp дуплексна ДНК част е частично лигирана. Последствието от това е, че ще се образуват димери от 200 bp, тримери от 300 bp, тетрамери от 400 bp, пентамери от 500 bp и т.н. Освен това, част от 100bp dsDNA ще остане. В резултат на това върху гела се създава ДНК "стълба", съставена от парчета ДНК с известна молекулна маса. [3]

Вторият метод използва използването на рестрикционни ензими и разпозната ДНК последователност. [3] ДНК се усвоява от определен рестрикционен ензим, което води до ДНК парчета с различна молекулна маса. Едно от предимствата на този метод е, че може лесно да се създаде повече маркер просто чрез усвояване на повече от известната ДНК. [3] От друга страна, размерът на ДНК парчетата се основава на местата, където рестрикционният ензим се разрязва. Това прави по-трудно контролирането на размера на фрагментите в маркера. [5]

Съвсем наскоро в лабораториите се използва друг метод за конструиране на маркери с размер на молекулно тегло на ДНК. Тази стратегия включва използването на полимеразна верижна реакция (PCR). [5] Това се постига по един или два начина: 1) ДНК мишена се амплифицира едновременно чрез набори от праймери, или 2) различни ДНК мишени се амплифицират независимо чрез определени праймери. [5]

Ефекти от условията на гела Редактиране

Както при експерименталните проби, условията на гела могат да повлияят на маркера за размер на молекулното тегло, който минава покрай тях. Фактори като буфер, заряд/напрежение и концентрация на гела могат да повлияят на мобилността и/или външния вид на вашия маркер/стълба/стандарт. Тези елементи трябва да се вземат предвид при избора на маркер и при анализа на крайните резултати върху гел.

Развитие Редактиране

Преди това протеиновите маркери бяха разработени с помощта на различни цели протеини. Разработването на комплект, включващ маркер за размер на молекулно тегло, базиран на протеинови фрагменти, започва през 1993 г. Този протеинов маркер, съставен от 49 различни аминокиселинни последователности, включва мултидомейни протеини и позволява анализ на протеини, разцепени на различни места. [9]

Настоящите подобрения на техниката в протеиновите маркери включват използването на автоматично развитие. Първият автоматично разработен протеинов маркер с редовно тегло е изобретен през 2012 г. [10]

Редактиране на дизайна

Подобно на ДНК маркерите, тези маркери обикновено са съставени от пречистени протеини, чиято молекулна маса вече е известна. [3] Списъкът по-долу очертава някои от протеините, както и молекулната маса, които обикновено се използват при конструирането на протеинов маркер.

Избор на правилния протеинов маркер Редактиране

Маркерите за размер на молекулно тегло могат да бъдат разделени на две категории: маркери за молекулно тегло срещу маркери с молекулярна стълба. [14] Маркерите са или оцветени, или неоцветени и в зависимост от обстоятелствата единият може да е по-подходящ от друг. Маркерите за размер на молекулно тегло също могат да бъдат биохимично променени. [15] Конюгирането с биотин е най-често срещаното. Маркерите за размер на молекулно тегло се използват най-често при SDS-полиакриламиден гел електрофореза и Western blotting. С всички различни видове и употреби на маркери за размер на молекулно тегло е важно да изберете подходящия протеинов стандарт. Освен най-често срещаната употреба, като начин за изчисляване на молекулното тегло на пробите, други употреби включват позволяване на визуални доказателства за миграция на протеини и ефективност на трансфера и понякога дори се използват за положителна контрола. [16]

Маркерът за молекулно тегло е един вид протеинов стандарт. Те могат да бъдат предварително оцветени или неоцветени преди зареждане в зависимост от вида на експеримента, един може да бъде по-изгоден. И в двата случая те обикновено се изпълняват по външната лента на гела, докато пробата се зарежда в средните ленти. [14] Молекулните маркери са различни от протеиновите стълби по това, че са съставени от смес от естествени протеини, чиито спецификации са добре категоризирани, но не отговарят на цели числа. [14] Като цяло те са много по-евтини, но анализът позволява само приблизителна стойност на белтъците, разделени с електрофореза. [14] Протеиновата стълба е друг тип протеинов стандарт. Почти винаги са оцветени. [14] Протеиновите стълби се различават от молекулярните маркери по това, че са съставени от смес от високо пречистени протеини, чиито спецификации са известни и отговарят на цели числа. [14] Обикновено протеиновите стълби се състоят от 10-12 протеина. [14] В края на експеримента, след като настъпи миграция на размера, една лента ще представлява размера на всеки протеин, съдържащ се в стълбата. [17] Маркерите са равномерно разположени и анализът на размера, използващ тези маркери, дава възможност за точна стойност на протеина, който представлява интерес. В някои случаи, като метод за молекулярно потвърждение, MW маркерите се изпълняват с протеинови стълби за проверка. [14] Протеиновите маркери могат да бъдат неоцветени или предварително оцветени, но и двете имат своите предимства и недостатъци. [18] Опростената визуализация на разделянето и трансфера на протеини става възможна чрез използването на предварително оцветени маркери. [18] Те обикновено се използват както в SDS-полиакриламиден гел електрофореза, така и в Western blotting. В SDS-PAGE той позволява наблюдение на миграцията на протеини, тъй като протеиновите ленти ще се разделят и могат да се видят по време на електрофоретичен тест. При Western блотове, оцветените протеинови стандарти позволяват визуализацията на трансфер на протеин върху мембраната. [17] Въпреки това, определянията на размера не са толкова точни с тези маркери (вижте раздела за рекомбинантни и естествени маркери за допълнително обяснение). [18] Докато неоцветените маркери позволяват по-точни определяния на размера, те не могат да се видят, докато гелът работи. Като такъв, гелът трябва да бъде оцветен, за да се визуализират лентите. [19] Освен оцветени и неоцветени маркери, протеиновите маркери могат да се разглеждат като рекомбинантни и естествени. [18] Рекомбинантните маркери се състоят от рекомбинантни протеини, които са силно пречистени. Тези маркери са проектирани по такъв начин, че да подчертават определени характеристики. [18] Примери за тези характеристики включват маркери за афинитет и молекулни тегла, които са равномерно разположени един спрямо друг. [18] Естествените маркери, както подсказва името, са смес от протеини, които се срещат естествено. [18] Предварително оцветените естествени маркери работят добре за визуализация на разделяне на гел. Въпреки това, тези маркери са склонни да се свързват с петното по ковалентен начин в различни количества и на различни позиции. [18] Следователно получените ленти може да са по-широки. Това е особено вярно, когато се правят сравнения с предварително оцветени рекомбинантни маркери. Поради този ефект е вероятно определянето на молекулно тегло да бъде по-малко точни с предварително оцветените естествени маркери. [18] Протеиновите стандарти също могат да бъдат химически променени. Често срещана промяна е чрез използването на биотин. Биотинът има много висок афинитет към стрептавидин и следователно свързването образува много силен комплекс. За визуализация към стрептавидина е прикрепен цветен етикет. [15]

Ефекти от условията на гела Редактиране

Както при ДНК електрофорезата, при избора на протеинов маркер трябва да се вземат предвид условия като буфери, заряд/напрежение и концентрация.

Буферите могат да повлияят на мобилността както на маркера, така и на пробите. pH на буфера варира в зависимост от използваната система и следователно всяка буферна система ще има различен ефект върху заряда на протеин или протеини. [20] В допълнение, в случая на SDS-PAGE, афинитетът на свързване към SDS може да бъде повлиян от буферната система. [20] Дори когато се използва същият процент и тип гел, едни и същи протеини ще мигрират с различна скорост в зависимост от използвания буфер. [20] Напрежението играе роля в мобилността на протеините върху гела. Протеините ще мигрират по-бързо при по-високо напрежение. Следователно времето за действие на гела ще бъде по-кратко. Обратно, по-високите напрежения могат да доведат до по-голяма дифузия на лентата. [20] Също така, ако напрежението е твърде високо, температурата в електрофорезната камера може да стане такава, че гелът да започне да се топи. [20] Напрежението, при което трябва да работи един гел, зависи от вида на гела. За някои гелове напрежението остава постоянно през целия цикъл, докато при други гелове първоначалното напрежение се оставя да остане постоянно за определено време, преди да се увеличи. [20] След това това второ напрежение се използва за определен период от време, след което може също да се увеличи. [20] По отношение на проценти, геловете, използвани за електрофореза на протеини, могат да бъдат разделени на еднопроцентни гелове и градиентни гелове. [18] Еднопроцентните гелове се наричат ​​още линейни гелове. [20] За линейните гелове избраният процент обикновено пада между 7,5% и 20%. [18] Обичайните процентни диапазони за градиентни гелове са 4-15% и 10-20%. Всеки вид гел има своите предимства. [18] Например, линейните гелове се предпочитат, когато няколко протеина имат сходни молекулни тегла, по-доброто разделяне между тези протеини ще бъде показано от линеен гел. [18] От друга страна, градиентните гелове са по-добър избор, когато интересуващите ни проби съдържат протеини с много различни молекулни тегла или които покриват голям диапазон от молекулни тегла. [18] [20]

Развитие Редактиране

РНК стълби, съставени от РНК маркери с размер на молекулно тегло, първоначално са разработени чрез използване на метода на синтетичния кръг [21] за производство на маркери с различен размер. Тази техника е подобрена от изобретателя Eric T. Kool, за да използва кръгови ДНК вектори като метод за производство на маркери с размер на молекулно тегло на РНК. Наричан методът на въртящия се кръг, подобренията на тази техника произтичат от нейната ефективност при синтезиране на РНК олигонуклеотиди. От кръговата ДНК матрица може да се произведе едноверижна РНК с различна дължина от 4-1500 bp без нужда от праймери и чрез рециклиране на нуклеотид трифосфат. ДНК може също да се синтезира от кръговия шаблон, което добавя към гъвкавостта на тази техника. В сравнение с транскрипцията на оттока, методът на синтетичния кръг произвежда РНК олигонуклеотиди без оттичане. В сравнение с PCR, методът на синтетичния кръг произвежда РНК олигонуклеотиди без нужда от полимераза или термичен цикъл. Този метод също така е рентабилен в способността си да синтезира големи количества продукт при по-нисък процент грешки в сравнение с машинните синтезатори. [21]

Редактиране на дизайна

РНК маркерите се състоят от РНК транскрипти с различни нарастващи дължини. Например, маркерът Lonza 0,5-9 kbp [22] има ленти, маркиращи 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6 и 9 двойки килобази. Маркерите се разтварят в буфер за съхранение, като EDTA, и могат да имат срок на годност до 2 години, когато се съхраняват при -80 °C. За да използвате маркера, като например за Northern blot анализ, той първо се размразява и след това се оцветява, така че да може да бъде открит при гел електрофореза. Едно от най-често използваните багрила за маркери е етидиевият бромид.

Обхватът на конкретен маркер се отнася до разнообразие от ленти, които може да картографира. "Висок" диапазон се отнася до относително големи фрагменти (измерени в kb), докато "нисък" диапазон се отнася до маркери, които разграничават малки фрагменти (измерени в bp). Някои маркери дори могат да бъдат описани като „ултра-нисък диапазон“, [16] но още по-точен е микроРНК маркерът. МикроРНК маркер може да се използва за измерване на РНК фрагменти в рамките на дузина нуклеотиди, като 17-25 nt микроРНК маркер. [23]

Използвайте Редактиране

При еквивалентни молекулни тегла РНК ще мигрира по-бързо от ДНК. Въпреки това, както РНК, така и ДНК имат отрицателен линеен наклон между тяхното миграционно разстояние и логаритмично молекулно тегло. [24] Тоест проби с по-малко тегло са в състояние да мигрират на по-голямо разстояние. Тази връзка се взема предвид при избора на РНК или ДНК маркери като стандарт.

Когато поставяте РНК маркери и РНК проби върху гел, е важно да се предотврати замърсяването с нуклеаза, тъй като РНК е много чувствителна към разграждането на рибонуклеаза (RNase) чрез катализа. [25] [26] Следователно трябва да се вземат предвид всички материали, които ще бъдат използвани в процедурата. Всяка стъклена посуда, която трябва да влезе в контакт с РНК, трябва да бъде предварително обработена с диетилпирокарбонат (DEPC), а пластмасовите материали трябва да бъдат за еднократна употреба. [25]

Една от най-честите употреби на маркери с размер на молекулно тегло е в гел електрофореза. Целта на гел електрофорезата е да раздели протеините по физични или химични свойства, които включват заряд, размер на молекулата и pH.< Когато се разделя въз основа на размера, идеалният метод е SDS-PAGE или електрофореза с полиакриламиден гел и маркерите за размер на молекулното тегло са подходящите стандарти за използване.

Геловете могат да варират по размер. Броят на пробите, които трябва да бъдат пуснати, ще определи подходящия размер на гела. Всички гелове са разделени на ленти, които минават успоредно през гела. Всяка лента ще съдържа конкретна проба. Обикновено стандартите за размер на молекулно тегло се поставят във външна лента. Ако гелът има особено голям брой ленти, тогава могат да се поставят множество стълби през гела за по-голяма яснота.

Протеините и стандартите се пипетират върху гела в подходящи ленти. Натриевият додецил сулфат (SDS) взаимодейства с протеините, денатурира ги и им придава отрицателен заряд. Тъй като всички протеини имат еднакво съотношение заряд към маса, мобилността на протеина през гела ще се основава единствено на молекулното тегло. След като електрическото поле се включи, ще започне миграцията на протеини. След завършване може да се използва механизъм за откриване като Western blotting, който ще разкрие наличието на ленти. Всяка лента представлява специфичен протеин. Разстоянието на пътуването се основава единствено на молекулното тегло, следователно, молекулното тегло на всеки протеин може да се определи чрез сравняване на разстоянието на неизвестен протеин със стандарта за известно молекулно тегло. [27]

Съществуват много видове маркери за размер на молекулно тегло и всеки притежава уникални характеристики, което дава възможност за участието им в редица биологични техники. Изборът на маркер с размер на молекулно тегло зависи от типа на маркера (ДНК, РНК или протеин) и диапазона на дължината, който предлага (например 1 kb). Преди да изберете маркер за размер на молекулно тегло, важно е да се запознаете с тези характеристики и свойства. В конкретен случай един вид може да е по-подходящ от друг. Въпреки че специфичните маркери могат да варират между протоколите за дадена техника, този раздел ще очертае общите маркери и техните роли.

Алозими Редактиране

Първият тип молекулярни маркери, разработени и използвани при гел електрофореза, са алозимите. Тези маркери се използват за откриване на протеинови вариации. Думата "алозим" (известна още като "алоензим") идва от "алелни варианти на ензими". [28] Когато се работи върху гел, протеините се разделят по размер и заряд. Въпреки че алозимите може да изглеждат остарели в сравнение с другите налични маркери, те все още се използват днес, главно поради ниската им цена. Един основен недостатък е, че тъй като има само ограничено количество, специфичността е проблем. [28]

ДНК-базирани маркери (1960-те) Редакт

Въпреки че алозимите могат да открият вариации в ДНК, това е чрез индиректен метод и не е много точен. ДНК-базираните маркери са разработени през 60-те години на миналия век. [28] Тези маркери са много по-ефективни при разграничаването между вариантите на ДНК. Today these are the most commonly used markers. DNA-based markers work by surveying nucleotides, which can serve a variety of functions, such as detecting differences in nucleotides or even quantifying the number of mutations. [28]

Restriction fragment length polymorphism is a technique used to detect variations in homologous DNA. [29] Specific restriction endonucleases are used to digest DNA. The RFLP molecular marker is specific to a single fragment. Along with alleic RFLP markers, a molecular-weight size marker, in this case a DNA marker, [30] is also included on an electorphoresed agarose gel. The DNA marker allows for the size of the restriction fragments to be estimated. Similar to RFLP, this technique also uses restriction endonucleases to digest the genomic DNA. Minisatellites are short sequences of tandem repeats, approximately 10-60 base pairs. Minisatellites can be used in DNA footprinting and as regulators of gene control. [28]

PCR-based markers (1980s) Edit

The success of DNA based markers lead to the development of PCR. PCR (polymerase chain reaction) is a DNA amplification technique that can be applied to various types of fragments. Prior to this development, to amplify DNA, it had to be cloned or isolated. Shortly after the discovery of PCR came the idea of using PCR-based markers for gel electrophoresis. These type of markers are based on PCR primers and are categorized as DNA sequence polymorphism. [28]

DNA sequence polymorphism Edit

Although technically speaking, DNA sequence polymorphism has been going on since the use of RFLP in the 1960s, the analysis has changed significantly over the years. DNA sequence polymorphism uses older techniques like RFLP, but on a larger scale. Sequencing is much faster and more efficient. The analysis is automated, as it uses a technique known as shotgun sequencing. This high-throughput method is commonly used in population genetics. [28]

SNPs (single nucleotide polymorphism), are used to detect variations in single nucleotides. The technique is very similar to that of RFLP. SNPs are used frequently for population genetic studies. [35] After amplification through PCR, these small fragments can be visualized using gel electrophoresis, and again DNA markers play a role in determining fragment length.

Polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis Edit

Carbohydrate markers are employed in a technique known as polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE), which is a measurable separation technique. [36] It allows for the analysis of enzyme hydrolysis products. [36] It has been used in applications such as characterizing enzymes involved in hemicellulose degradation, determining the structure of hemicellulose polysaccharides, and analysis of enzymatic cleavage of cellulose products. [36]

PACE depends on derivitization, which is the conversion of a chemical compound into a derivative. [36] [37] Here monosaccharides, oligosaccharides, and polysaccharides are the compounds of interest. They are labeled at their reducing ends with a fluorescent label (i.e. a fluorophore). [36] This derivitization with a fluorophore permits both separation on a gel under the desired circumstances and fluorescence imaging of the gel. In this case, a polyacrylamide gel is used. [36]

As with DNA, RNA, and protein electrophoresis, markers are run alongside the samples of interest in carbohydrate gel electrophoresis. [36] The markers consist of oligosaccharides of known molecular weight. Like the samples of interest, the marker is also derivitized with a fluorophore (usually with 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid (ANTS) or 2-aminoacridone). [36]


James Watson (1928-)

James Dewey Watson was born in Chicago. As a child, he was bright and inquisitive. One of his favorite words was "why?" and he wasn't satisfied with simple answers. He accumulated a lot of knowledge by reading the World Almanac, and won $100 as a "Quiz Kid" on a popular radio program. He used this money to buy binoculars for bird-watching ? a serious hobby for himself and his father.

Watson entered the University of Chicago at 15 under the gifted youngster program. He did well in courses that interested him, like biology and zoology, and not as well in other courses. He decided that he would go to graduate school and study to become the curator of ornithology at the Museum of Natural History.

In his senior year at Chicago, Watson read Erwin Schrödinger's book: Какво е живот? Физическият аспект на живата клетка. He was fascinated by the idea that genes and chromosomes hold the secrets of life. When Watson went to do a Ph.D. with Salvador Luria, a pioneer in bacteriophage research, at Indiana University, it seemed the perfect opportunity to work on some of these problems.

After his Ph.D. in 1950, Watson spent time in Europe, first in Copenhagen and then at the Cavendish Laboratory of the University of Cambridge. By now, Watson knew that DNA was the key to understanding life and he was determined to solve its structure. He was lucky to share an office with Francis Crick, a Ph.D. student who was also interested in the structure of DNA. Although both were supposed to be working on other projects, in 1953, they built the first accurate model of DNA ? one of the great scientific advances of all time.

In 1962, Watson shared the Nobel Prize for Physiology or Medicine with Francis Crick and Maurice Wilkins who, with Rosalind Franklin, provided the data on which the structure was based. Watson wrote The Double Helix: A Personal Account of the Discovery of the Structure of DNA, which was published in 1968. This book was the first of its kind, being a gossipy account of the inner workings of the scientific world, and has never been out of print.

In 1956, Watson accepted a position in the Biology department at Harvard University where the focus of his research was RNA and its role in the transfer of genetic information. Although he continued to be a member of the Harvard faculty until 1976, Watson took over the directorship of Cold Spring Harbor Laboratory in 1968.

Watson has had a long association with Cold Spring Harbor Lab. Salvador Luria and Max Delbrück taught a popular summer course on phage genetics, and during his graduate days, Watson enjoyed this "summer camp" for scientists. Watson has made Cold Spring Harbor Laboratory one of the world's premier research facilities for cancer, neurobiology, and basic molecular genetics. Watson retired as the President of Cold Spring Harbor Laboratory in 2004, and is now Chancellor Emeritus.

Watson has played a significant role in the development of science policy, from the War on Cancer, through the debates over the use of recombinant DNA, to promoting the Human Genome Project. From 1988 to 1992, he ran the Human Genome Project at the National Institutes of Health while still directing Cold Spring Harbor Laboratory.

One of his major interests is education. His first textbook, Молекулярна биология на гена, set new standards for biology textbooks, and it was followed by Молекулярна биология на клетката, и Recombinant DNA. He is actively exploring the avenue of multimedia education and the WWW through projects being developed at the DNA Learning Center, the educational arm of Cold Spring Harbor Laboratory. He was and is one of the main motivators of this project, ДНК от самото начало.

Watson has been described by many as brilliant, outspoken and eccentric. He is energized by intelligent people and doesn't suffer fools. Watson is an avid tennis player and has been ever since his grad school days. He still tries to play tennis every day.

DNA was first crystallized in the late 70's &mdash remember, the 1953 X-ray data were from DNA fibers. So, the real "proof" for the Watson-Crick model of DNA came in 1982 after the B-form of DNA was crystallized and the X-ray pattern was solved.

If the DNA of one human cell is stretched out, it would be almost 6 feet long and contain over three billion base pairs. How does all this fit into the nucleus of one cell?


Sequencing Genomes

Traditional sequencing of genomes was a long and tedious process that cloned fragments of genomic DNA into plasmids to generate a genomic DNA library ( gDNA ). These plasmids were individually sequenced using Sanger sequencing methodology and computational was performed to identify overlapping pieces, like a jigsaw puzzle. This assembly would result in a draft scaffold.

The video below is taken from yourgenome.org (CC-BY) and illustrates the sequencing of the human genome through the shotgun sequencing approach.



Коментари:

  1. Colbert

    Извинявам се, но това не ми идва.

  2. Philips

    не е зле!

  3. Vumuro

    Според мен се допускат грешки. Пиши ми на ЛС.

  4. Kafele

    Мисля, че той греши. Сигурен съм. Нека се опитаме да обсъдим това.



Напишете съобщение