Информация

Имунитетът към CRISPR протеини ограничава ли тяхната ефективност?

Имунитетът към CRISPR протеини ограничава ли тяхната ефективност?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Използването на системи crisper-cas понастоящем се прилага за клетки, култивирани in vitro. Тъй като контролът върху ефектите на Crispr „извън целта“ се подобрява и Crispr се използва in vivo, защо имунната система няма да го неутрализира?


Обикновено не. протеините Crispr/Cas могат да бъдат доставени в клетката като ДНК/РНК и протеините ще съществуват вътре в клетката само в малък брой.

Дори в системи, които доставят протеина отвън in vivo почти винаги протеините ще бъдат капсулирани в система за доставяне, за да се гарантира, че те и всички необходими придружаващи нуклеинови киселини попадат в клетката. Вкарването на Crispr/Cas в клетка е трудно да се направи и те не се появяват сами. Те също така изискват водеща РНК, която няма лесно да остане цяла в кръвния поток и тъканите за дълго.

ако искате просто да инжектирате течност в кръвта с незащитени CRISPR/CAS протеини, имунна реакция може да ги спре. Не всички протеини предизвикват имунна реакция. Понякога само 2-3 протеина от цяла бактерия произвеждат имунна реакция (антитела). Но отново е малко вероятно протеините да редактират някакви геноми в която и да е клетка гостоприемник, дори и така.


CRISPR-Cas9 в редактирането на генома: Неговата функция и медицински приложения

Целевата модификация на генома с помощта на РНК-управлявани нуклеази е свързана с няколко предимства, като бърз, лесен и ефективен метод, който не само осигурява манипулиране и промяна на гени и функционални изследвания за изследователите, но също така повишава тяхната осведоменост за молекулярната основа на заболяването и разработването на нови и целенасочени терапевтични подходи. Появиха се различни техники, доколкото молекулярните ножици медиират насочено редактиране на генома, включително нуклеаза на цинков пръст, ефекторни нуклеази, подобни на транскрипционен активатор, и групирани редовно взаимно разположени къси палиндромни повторения (CRISPR)-CRISPR-свързан протеин 9 (Cas9). CRISPR-Cas9 е бактериална имунна система срещу вируси, в която едноверижната РНК-управлявана Cas9 нуклеаза е свързана с целевите комплементарни последователности за прилагане на промени. Напредъкът, постигнат в трансфера, модификацията и появата на специфични решения, доведе до създаването на различни класове CRISPR-Cas9. Тъй като този здрав инструмент е способен на директна корекция на болестотворни мутации, способността му да лекува генетични заболявания привлече огромното внимание на изследователите. Като се имат предвид съобщените случаи на неспецифично насочване на протеини Cas9, много проучвания се фокусират върху подобряването на характеристиките на Cas9. В тази връзка е постигнат значителен напредък при избора на водеща РНК, нови ензими и методи за идентифициране на неправилно насочване. Тук ние подчертахме историята и различни преки аспекти на CRISPR-Cas9, като прецизност при геномно насочване, трансфер на системата и контрол върху корекционните събития с неговите приложения в бъдещи биологични изследвания и съвременно лечение на заболявания.

Ключови думи: CRISPR-Cas9 геном за редактиране на нови лечения, специфично насочване.


Компонентите на CRISPR-Cas работят заедно, за да подобрят защитата от вируси

Кредит: CC0 Public Domain

Изследователи от Сколтех и техните колеги от Русия и САЩ показаха, че двата компонента на бактериалната имунна система CRISPR-Cas, единият, който унищожава чужди генетични елементи като вируси, и друг, който създава „спомени“ за чужди генетични елементи чрез съхраняване на фрагменти от тяхната ДНК в специално място на бактериалния геном, са физически свързани. Тази връзка помага на бактериите да актуализират ефективно имунната си памет, когато са заразени от мутантни вируси, които са се научили да избягват защитата на CRISPR-Cas. Документът е публикуван в списанието Известия на Националната академия на науките.

CRISPR-Cas, защитен механизъм, който осигурява на бактериите резистентност към техните вируси (бактериофаги), унищожава ДНК от по-рано срещнати противници, като я „сравнява“ със спейсери, кратки битове генетична информация, съхранявана като „библиотека“ в „чип с памет“ разположени в специално място на бактериалния геном. CRISPR-Cas се „научава“ да разпознава нови врагове чрез включване на нови, извлечени от вируси разделители в тази библиотека по време на инфекцията. Двата етапа на функциониране на CRISPR, придобиване на разделители и тяхното използване за борба с реинфекции, се наричат ​​съответно адаптация и интерференция.

„За да избегнат CRISPR, фагите придобиват мутации, които въвеждат несъответствия със спейсери. Така че, за да поддържа ефективна защита, системата CRISPR-Cas трябва да актуализира набора от разделители по-бързо, отколкото възникват мутантни фаги с escape мутации. За да отговори на това изискване, CRISPR -Cas системите са разработили специален механизъм на грундирана адаптация. По време на грундирана адаптация, съществуващите разделители, които разпознават цел, дори неефективно, насърчават много ефективно придобиване на допълнителни спейсери от същата ДНК молекула, върху която е разположена целта", Олга Мушарова, Сколтех изследовател и първият автор на статията, обяснява.

Точният молекулен механизъм на прайминг все още е неясен, но изисква тясна координация между убиващите и запаметяващите части на механизма CRISPR. В новата статия професорът от Сколтех Константин Северинов, Мушарова и техните колеги успяха да потвърдят съществуването на праймиращ комплекс, който включва както протеините Cas1-Cas2, отговорни за придобиването на нови спейсери, така и протеина Cas3, който разцепва вражеската ДНК.

„Частът, който унищожава чужда ДНК и частта, която придобива нова информация за бъдещата защитна функция на системата CRISPR-Cas, са свързани. Сякаш чукчето в играта Whac-A-Mole също може да прави снимки на бенките за бъдещи справки “, каза Северинов.

В експерименти с E. coli екипът показа, че фрагменти от ДНК, разградени от Cas3, се предават директно на Cas1-Cas2 като "предварителни спейсери", които в крайна сметка стават спейсери. „Този ​​резултат е от фундаментално значение. Разкрихме връзката между интерференцията и процесите на адаптация“, казва Мушарова. "Нашите открития също показват как адаптацията на CRISPR може да бъде по-ефективна, което е важно за използването на бактериални популации за съхранение на информация."

Екипът планира да продължи да изследва подготвената адаптация в бактериалните клетки и да намери най-ефективния начин за инсталиране на желаните „спомени“ в бактериалната ДНК под формата на разделители.


Препратки

Wu, J. et al. Цикличният GMP-AMP е ендогенен втори пратеник при вродената имунна сигнализация чрез цитозолна ДНК. наука 339, 826–830 (2013).

Eaglesham, J. B. & amp Kranzusch, P. J. Запазени стратегии за избягване на патогени на имунитета на cGAS-STING. Curr. Opin. Immunol. 66, 27–34 (2020).

Cheng, Z. et al. Взаимодействията между пътя на cGAS-STING и патогените. Сигнал. Трансдукт. Цел. Тер. 5, 91 (2020).

Tock, M. R. & Dryden, D. T. Биологията на рестрикцията и анти-рестрикцията. Curr. Opin. Microbiol. 8, 466–472 (2005).

Barrangou, R. et al. CRISPR осигурява придобита резистентност срещу вируси в прокариотите. наука 315, 1709–1712 (2007).

Marraffini, L. A. & amp Sontheimer, E. J. CRISPR интерференцията ограничава хоризонталния трансфер на ген в стафилококи чрез насочване към ДНК. наука 322, 1843–1845 (2008).

Hampton, H.G., Watson, B.N.J. & Fineran, P.C. Надпреварата във въоръжаването между бактериите и техните фагови врагове. природата 577, 327–336 (2020).

Deveau, H. et al. Фагов отговор към CRISPR-кодирана резистентност в Streptococcus thermophilus. J. Бактериол. 190, 1390–1400 (2008).

Mendoza, S.D. et al. Компартмент, подобен на ядро ​​на бактериофаг, предпазва ДНК от CRISPR нуклеази. природата 577, 244–248 (2020).

Malone, L.M. et al. Джъмбо фаг, който образува структура, подобна на ядро, избягва насочването на CRISPR-Cas ДНК, но е уязвим към имунитет, базиран на РНК тип III. Нац. Microbiol. 5, 48–55 (2020).

Samson, J. E., Magadan, A. H., Sabri, M. & Moineau, S. Отмъщението на фагите: побеждаване на бактериалната защита. Нац. Rev. Microbiol. 11, 675–687 (2013).

Labrie, S. J., Samson, J. E. & Moineau, S. Механизми за резистентност на бактериофаги. Нац. Rev. Microbiol. 8, 317–327 (2010).

Bondy-Denomy, J., Pawluk, A., Maxwell, K.L. & Davidson, A.R. Бактериофагови гени, които инактивират CRISPR/Cas бактериалната имунна система. природата 493, 429–432 (2013). Тази новаторска статия съобщава за първия анти-CRISPR във фагите на P. aeruginosa.

Макарова, K.S. et al. Еволюционна класификация на системите CRISPR-Cas: взрив от клас 2 и производни варианти. Нац. Rev. Microbiol. 18, 67–83 (2020).

Макарова, K.S. et al. Актуализирана еволюционна класификация на системите CRISPR-Cas. Нац. Rev. Microbiol. 13, 722–736 (2015).

van der Oost, J., Westra, E. R., Jackson, R. N. & amp Wiedenheft, B. Разкриване на структурната и механистична основа на системите CRISPR-Cas. Нац. Rev. Microbiol. 12, 479–492 (2014).

Marraffini, L. A. CRISPR-Cas имунитет при прокариоти. природата 526, 55–61 (2015).

Andersson, A. F. & amp Banfield, J. F. Динамика на вирусната популация и придобита вирусна резистентност в естествени микробни общности. наука 320, 1047–1050 (2008).

Childs, L. M., England, W. E., Young, M. J., Weitz, J. S. & amp Whitaker, R. J. CRISPR-индуциран разпределен имунитет в микробни популации. PLOS ONE 9, e101710 (2014).

Paez-Espino, D. et al. CRISPR имунитетът задвижва бързата еволюция на фагов геном в Streptococcus thermophilus. mBio 6, e00262-15 (2015).

Bondy-Denomy, J. et al. Обединен ресурс за проследяване на анти-CRISPR имена. CRISPR J. 1, 304–305 (2018).

Maji, B. et al. Високопроизводителна платформа за идентифициране на инхибитори с малки молекули на CRISPR-Cas9. клетка 177, 1067–1079 e1019 (2019). Тази статия демонстрира първата идентификация на инхибитори на CRISPR-Cas9 с малка молекула, използвайки високопроизводителна скринингова платформа.

Hwang, S. & Maxwell, K.L. Запознайте се с анти-CRISPRs: широко разпространени протеинови инхибитори на CRISPR-Cas системи. CRISPR J. 2, 23–30 (2019).

Davidson, A.R. et al. Анти-CRISPRs: протеинови инхибитори на CRISPR-Cas системи. Ану. Rev. Biochem. 89, 309–332 (2020).

Wiegand, T., Karambelkar, S., Bondy-Denomy, J. & amp Wiedenheft, B. Структури и стратегии на анти-CRISPR-медиирана имунна супресия. Ану. Rev. Microbiol. 74, 21–37 (2020).

Zhang, F., Song, G. & Tian, ​​Y. Anti-CRISPRs: естествените инхибитори за CRISPR-Cas системи. Anim. Модел. Exp. Мед. 2, 69–75 (2019).

Zhu, Y., Zhang, F. & amp Huang, Z. Структурни прозрения за инактивирането на CRISPR-Cas системи от различни анти-CRISPR протеини. BMC Biol. 16, 32 (2018).

Stanley, S.Y. & Maxwell, K.L. Phage-кодирани анти-CRISPR защити. Ану. Преподобният Жене. 52, 445–464 (2018).

Pawluk, A., Davidson, A. R. & Maxwell, K.L. Anti-CRISPR: откритие, механизъм и функция. Нац. Rev. Microbiol. 16, 12–17 (2018).

Sontheimer, E.J. & Davidson, A.R. Инхибиране на CRISPR-Cas системи от мобилни генетични елементи. Curr. Opin. Microbiol. 37, 120–127 (2017).

Borges, A. L., Davidson, A. R. & Bondy-Denomy, J. Откриването, механизмите и еволюционното въздействие на анти-CRISPR. Ану. преп. Вирол. 4, 37–59 (2017).

Trasanidou, D. et al. Поддържане на CRISPR под контрол: различни механизми на фаго-кодирани анти-CRISPR. FEMS Microbiol. Lett. 366, fnz098 (2019).

Marino, N. D., Pinilla-Redondo, R., Csorgo, B. & amp Bondy-Denomy, J. Anti-CRISPR протеинови приложения: естествени спирачки за CRISPR-Cas технологии. Нац. Методи 17, 471–479 (2020).

Shivram, H., Cress, B.F., Knott, G.J. & Doudna, J.A. Контролиране и подобряване на системите CRISPR. Нац. Chem. Biol. 17, 10–19 (2021).

Li, Y. & Bondy-Denomy, J. Анти-CRISPR стават вирусни: инфекциозната биология на инхибиторите на CRISPR-Cas. Клетъчен микроб гостоприемник https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.12.007 (2021).

Jinek, M. et al. Програмируема ДНК ендонуклеаза с двойна РНК в адаптивен бактериален имунитет. наука 337, 816–821 (2012).

Cong, L. et al. Мултиплексно геномно инженерство, използващо CRISPR/Cas системи. наука 339, 819–823 (2013).

Mali, P. et al. РНК-управлявано инженерство на човешкия геном чрез Cas9. наука 339, 823–826 (2013).

Qi, L.S. et al. Пренасочване на CRISPR като РНК-управлявана платформа за специфичен за последователността контрол на генната експресия. клетка 152, 1173–1183 (2013).

Hsu, P. D., Lander, E. S. & amp Zhang, F. Разработване и приложения на CRISPR-Cas9 за геномно инженерство. клетка 157, 1262–1278 (2014).

Адли, М. Комплектът от инструменти CRISPR за редактиране на генома и извън него. Нац. комун. 9, 1911 (2018).

Sander, J. D. & amp Joung, J. K. CRISPR-Cas системи за редактиране, регулиране и насочване към геноми. Нац. Биотехнология. 32, 347–355 (2014).

Kempton, H. R. & Qi, L. S. Когато редактирането на генома излезе извън целта. наука 364, 234–236 (2019).

Li, C. et al. HDAd5/35(++) аденовирусен вектор, експресиращ анти-CRISPR пептиди, намалява токсичността на CRISPR/Cas9 в човешки хематопоетични стволови клетки. Mol. Тер. Методи Clin. Разв. 9, 390–401 (2018).

Zhang, X., Bai, X. C. & Chen, Z. J. Структури и механизми в пътя на вродения имунитет на cGAS-STING. Имунитет 53, 43–53 (2020).

Brouns, S.J. et al. Малките CRISPR РНК ръководят антивирусната защита в прокариотите. наука 321, 960–964 (2008).

Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K. & amp Doudna, J. A. Обработка на РНК, специфична за последователността и структурата чрез ендонуклеаза CRISPR. наука 329, 1355–1358 (2010).

Jore, M.M. et al. Структурна основа за CRISPR РНК-управлявано ДНК разпознаване от Cascade. Нац. Структура. Mol. Biol. 18, 529–536 (2011).

Wiedenheft, B. et al. РНК-управляван комплекс от бактериална имунна система подобрява разпознаването на целта чрез взаимодействия на семенната последователност. Proc. Натл акад. Sci. САЩ 108, 10092–10097 (2011).

Sashital, D.G., Wiedenheft, B. & amp Doudna, J.A. Механизъм на селекция на чужда ДНК в бактериална адаптивна имунна система. Mol. клетка 46, 606–615 (2012).

Mojica, F. J. M., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J. & amp Almendros, C. Кратките мотивни последователности определят целите на прокариотната защитна система CRISPR. микробиология 155, 733–740 (2009).

Sinkunas, T. et al. Cas3 е едноверижна ДНК нуклеаза и АТФ-зависима хеликаза в CRISPR/Cas имунната система. EMBO Дж. 30, 1335–1342 (2011).

Sinkunas, T. et al. In vitro възстановяване на Cascade-медииран CRISPR имунитет в Streptococcus thermophilus. EMBO Дж. 32, 385–394 (2013).

Mulepati, S. & Bailey, S. In vitro възстановяване на an Ешерихия коли РНК-управляваната имунна система разкрива еднопосочно, АТФ-зависимо разграждане на ДНК мишена. J. Biol. Chem. 288, 22184–22192 (2013).

Hochstrasser, M.L. et al. CasA медиира катализирано от Cas3 разграждане на целта по време на интерференция, ръководена от CRISPR РНК. Proc. Натл акад. Sci. САЩ 111, 6618–6623 (2014).

Huo, Y. et al. Структурите на CRISPR Cas3 предлагат механистични прозрения за Cascade-активираната ДНК развиване и разграждане. Нац. Структура. Mol. Biol. 21, 771–777 (2014).

Леон, Л. М., Парк, А. Е., Борхес, А. Л., Джанг, J. Y. и Bondy-Denomy, J. Война на мобилни елементи чрез CRISPR и анти-CRISPR в Pseudomonas aeruginosa. Нуклеинови киселини Res. 49, 2114–2125 (2021).

Bondy-Denomy, J. et al. Множество механизми за инхибиране на CRISPR-Cas от анти-CRISPR протеини. природата 526, 136–139 (2015). Тази статия предоставя първия поглед върху анти-CRISPR-медиирани механизми за инхибиране.

Chowdhury, S. et al. Структурата разкрива механизми на вирусни супресори, които прихващат CRISPR РНК-управляван комплекс за наблюдение. клетка 169, 47–57 e11 (2017).

Guo, T.W. et al. Cryo-EM структурите разкриват механизъм и инхибиране на насочване на ДНК от комплекс за наблюдение CRISPR-Cas. клетка 171, 414–426 e412 (2017). Chowdhury et al. (2017) и Guo et al. (2017) съобщават за първите крио-ЕМ структури на анти-CRISPR от тип I многосубединица Каскаден комплекс.

Peng, R. et al. Алтернативни режими на свързване на анти-CRISPR вирусни супресори AcrF1/2 към комплекса за наблюдение на Csy, разкрити от крио-ЕМ структури. Cell Res. 27, 853–864 (2017).

Maxwell, K.L. et al. Структурата на разтвора на анти-CRISPR протеин. Нац. комун. 7, 13134 (2016).

Gabel, C., Li, Z., Zhang, H. & Chang, L. Структурна основа за инхибиране на комплекса за наблюдение от типа I-F CRISPR-Cas от AcrIF4, AcrIF7 и AcrIF14. Нуклеинови киселини Res. 49, 584–594 (2021).

Zhang, K. et al. Механизми на инхибиране на AcrF9, AcrF8 и AcrF6 срещу тип I-F CRISPR-Cas комплекс, разкрити от cryo-EM. Proc. Натл акад. Sci. САЩ 117, 7176–7182 (2020).

Hirschi, M. et al. AcrIF9 свързва неспецифична за последователността dsDNA към CRISPR РНК-управлявания комплекс за наблюдение. Нац. комун. 11, 2730 (2020). Тази статия очертава анти-CRISPR стратегия за насърчаване на неспецифичното свързване на dsDNA от комплекса Cascade.

Lu, W.T., Trost, C.N., Muller-Esparza, H., Randau, L. & Davidson, A.R. Анти-CRISPR AcrIF9 функционира чрез индуциране на CRISPR-Cas комплекса да свързва ДНК неспецифично. Нуклеинови киселини Res. 49, 3381–3393 (2021).

Kim, I. et al. Структурни и механистични прозрения за CRISPR инхибирането на AcrIF7. Нуклеинови киселини Res. 48, 9959–9968 (2020).

Niu, Y. et al. Протеин тип I-F Anti-CRISPR инхибира комплекса за наблюдение CRISPR-Cas чрез ADP-рибозилиране. Mol. клетка 80, 512–524 e515 (2020).

Wang, X. et al. Структурна основа на инхибирането на Cas3 от бактериофаговия протеин AcrF3. Нац. Структура. Mol. Biol. 23, 868–870 (2016).

Wang, J. et al. Еволюционна надпревара във въоръжаването на CRISPR: структурни прозрения за вирусните анти-CRISPR/Cas отговори. Cell Res. 26, 1165–1168 (2016).

McGinn, J. & Marraffini, L.A. Молекулни механизми на придобиване на CRISPR-Cas спейсер. Нац. Rev. Microbiol. 17, 7–12 (2019).

Pawluk, A. et al. Деактивиране на нуклеаза тип I-E CRISPR-Cas с бактериофаг-кодиран анти-CRISPR протеин. mBio https://doi.org/10.1128/mBio.01751-17 (2017).

Lin, J. et al. Насочването към ДНК чрез подтип I-D CRISPR-Cas показва характеристики от тип I и тип III. Нуклеинови киселини Res. 48, 10470–10478 (2020).

Той, F. et al. Анти-CRISPR протеини, кодирани от археални литични вируси, инхибират имунитет на подтип I-D. Нац. Microbiol. 3, 461–469 (2018).

Manav, M.C. et al. Структурна основа за инхибиране на голяма субединица CRISPR-Cas тип I-D от архей от анти-CRISPR протеин. Нац. комун. 11, 5993 (2020).

Mahendra, C. et al. Широкоспектърните анти-CRISPR протеини улесняват хоризонталния генен трансфер. Нац. Microbiol. 5, 620–629 (2020).

Mejdani, M., Pawluk, A., Maxwell, K.L. & Davidson, A.R. Anti-CRISPR AcrIE2 свързва комплекса тип I-E CRISPR-Cas, но не блокира свързването на ДНК. J. Mol. Biol. 433, 166759 (2020).

Jia, N. et al. Тип III-A CRISPR-Cas Csm комплекси: сглобяване, периодично разцепване на РНК, регулиране на ДНКазната активност и автоимунитет. Mol. клетка 73, 264–277 e265 (2019).

Вие, L. et al. Структурните изследвания на комплекса CRISPR-Csm разкриват механизъм на ко-транскрипционна интерференция. клетка 176, 239–253 e216 (2019).

Huo, Y. et al. Cryo-EM структура на ефекторен комплекс от тип III-A CRISPR. Cell Res. 28, 1195–1197 (2018).

Guo, M. et al. Свързване на ssRNA разцепване с ДНКазна активност в тип III-A CRISPR-Csm, разкрито чрез крио-ЕМ и биохимия. Cell Res. 29, 305–312 (2019).

Sofos, N. et al. Структурите на комплекса Cmr-beta разкриват регулацията на имунния механизъм на тип III-B CRISPR-Cas. Mol. клетка 79, 741–757 e747 (2020).

Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M. & Terns, M. P. Cas6 е ендорибонуклеаза, която генерира водещи РНК за защита от нашественик в прокариоти. Genes Dev. 22, 3489–3496 (2008).

Hale, C.R. et al. РНК-управлявано РНК разцепване от CRISPR RNA-Cas протеинов комплекс. клетка 139, 945–956 (2009).

Samai, P. et al. Ко-транскрипционно разцепване на ДНК и РНК по време на имунитет от тип III CRISPR-Cas. клетка 161, 1164–1174 (2015).

Kazlauskiene, M., Tamulaitis, G., Kostiuk, G., Venclovas, C. & Siksnys, V. Пространствено-временен контрол на имунитет от тип III-A CRISPR-Cas: свързване на разграждането на ДНК с разпознаването на целевата РНК. Mol. клетка 62, 295–306 (2016).

Kazlauskiene, M., Kostiuk, G., Venclovas, C., Tamulaitis, G. & Siksnys, V.Цикличен олигонуклеотиден сигнален път в CRISPR-Cas системи тип III. наука 357, 605–609 (2017).

Niewoehner, O. et al. Системите CRISPR-Cas тип III произвеждат циклични олигоаденилатни вторични пратеници. природата 548, 543–548 (2017).

Tamulaitis, G. et al. Програмируемо раздробяване на РНК чрез системата CRISPR-Cas тип III-A на Streptococcus thermophilus. Mol. клетка 56, 506–517 (2014).

Elmore, J.R. et al. Двустранното разпознаване на прицелните РНК активира разцепването на ДНК от системата тип III-B CRISPR-Cas. Genes Dev. 30, 447–459 (2016).

Rouillon, C., Athukoralage, J.S., Graham, S., Gruschow, S. & White, M.F. Контрол на цикличния олигоаденилатен синтез в CRISPR система тип III. eLife 7, e36734 (2018).

Jia, N., Jones, R., Sukenick, G. & Patel, D.J. Образуване на втори месинджър cA4 в композитния Csm1 джоб на дланта от тип III-A CRISPR-Cas Csm комплекс и пътя на неговото освобождаване. Mol. клетка 75, 933–943 e936 (2019).

Foster, K., Kalter, J., Woodside, W., Terns, R. M. & Terns, M. P. Рибонуклеазната активност на Csm6 е необходима за анти-плазмиден имунитет от тип III-A CRISPR-Cas системи. RNA Biol. 16, 449–460 (2019).

Hatoum-Aslan, A., Maniv, I., Samai, P. & Marraffini, L.A. Генетична характеристика на антиплазмиден имунитет чрез система от тип III-A CRISPR-Cas. J. Бактериол. 196, 310–317 (2014).

Rostøl, J.T. & Marraffini, L.A. Неспецифичното разграждане на транскриптите насърчава клирънса на плазмида по време на имунитет от тип III-A CRISPR-Cas. Нац. Microbiol. 4, 656–662 (2019).

Jia, N., Jones, R., Yang, G., Ouerfelli, O. & Patel, D. J. CRISPR-Cas III-A Csm6 CARF домейн е пръстенна нуклеаза, задействаща стъпаловидно разцепване на cA4 с образуване на ApA>p, прекратяващо РНКазната активност. Mol. клетка 75, 944–956 e946 (2019).

Molina, R. et al. Структурата на комплекса Csx1-cOA4 разкрива основата на разпадането на РНК в тип III-B CRISPR-Cas. Нац. комун. 10, 4302 (2019).

Garcia-Doval, C. et al. Механизми за активиране и самоинактивиране на цикличната олигоаденилат-зависима CRISPR рибонуклеаза Csm6. Нац. комун. 11, 1596 (2020).

Smalakyte, D. et al. Свързаният с CRISPR протеин тип III-A Csm6 разгражда цикличния хекса-аденилатен активатор, използвайки както CARF, така и HEPN домени. Нуклеинови киселини Res. 48, 9204–9217 (2020).

Cohen, D. et al. Цикличната GMP-AMP сигнализация предпазва бактериите от вирусна инфекция. природата 574, 691–695 (2019).

Lowey, B. et al. CBASS имунитетът използва свързани с CARF ефектори, за да усети 3′-5′- и 2′-5′-свързани циклични олигонуклеотидни сигнали и да предпазва бактериите от фагова инфекция. клетка 182, 38–49 e17 (2020).

Bhoobalan-Chitty, Y., Johansen, T. B., Di Cianni, N. & amp Peng, X. Инхибиране на имунитет тип III CRISPR-Cas от кодиран от археален вирус анти-CRISPR протеин. клетка 179, 448–458 e411 (2019).

Wu, J. J. et al. Инхибиране на cGAS ДНК отчитане от херпесвирусен вирионен протеин. Клетъчен микроб гостоприемник 18, 333–344 (2015).

Zhang, J. et al. Специфичното за видовете дезамидиране на cGAS от UL37 протеин на херпес симплекс вирус улеснява вирусната репликация. Клетъчен микроб гостоприемник 24, 234–248 e235 (2018).

Athukoralage, J.S. et al. Анти-CRISPR вирусна пръстенна нуклеаза подкопава CRISPR имунитета тип III. природата 577, 572–575 (2020). Тази статия описва вирусна пръстенна нуклеаза, която разгражда вторичните пратеници на cOA.

Eaglesham, J. B., Pan, Y., Kupper, T. S. & amp Kranzusch, P. J. Вирусните и метазоански поксини са cGAMP-специфични нуклеази, които ограничават сигнализирането на cGAS-STING. природата 566, 259–263 (2019).

Yan, N., Regalado-Magdos, A.D., Stiggelbout, B., Lee-Kirsch, M.A. & Lieberman, J. Цитозолната екзонуклеаза TREX1 инхибира вродения имунен отговор към вируса на човешкия имунодефицит тип 1. Нац. Immunol. 11, 1005–1013 (2010).

Aguirre, S. et al. Протеинът NS2B на вируса на денга е насочен към cGAS за разграждане и предотвратява разпознаването на митохондриална ДНК по време на инфекция. Нац. Microbiol. 2, 17037 (2017).

Aguirre, S. et al. DENV инхибира производството на IFN тип I в инфектирани клетки чрез разцепване на човешки STING. PLoS Patog. 8, e1002934 (2012).

Sapranauskas, R. et al. Системата Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas осигурява имунитет при Escherichia coli. Нуклеинови киселини Res. 39, 9275–9282 (2011).

Deltcheva, E. et al. Узряване на CRISPR РНК чрез транс-кодирана малка РНК и гостоприемников фактор РНКаза III. природата 471, 602–607 (2011).

Jinek, M. et al. Структурите на Cas9 ендонуклеазите разкриват РНК-медиирана конформационна активация. наука 343, 1247997 (2014).

Nishimasu, H. et al. Кристална структура на Cas9 в комплекс с водеща РНК и целева ДНК. клетка 156, 935–949 (2014).

Zhu, Y. et al. Разнообразни механизми на инхибиране на CRISPR-Cas9 от тип IIC анти-CRISPR протеини. Mol. клетка 74, 296–309 e297 (2019).

Thavalingam, A. et al. Инхибиране на сглобяването на рибонуклеопротеинов комплекс CRISPR-Cas9 от анти-CRISPR AcrIIC2. Нац. комун. 10, 2806 (2019).

Osuna, B.A. et al. Фагите на листерията предизвикват разграждане на Cas9 за защита на лизогенни геноми. Клетъчен микроб гостоприемник 28, 31–40 (2020).

Osuna, B.A. et al. Критична анти-CRISPR локусна репресия от бифункционален инхибитор на Cas9. Клетъчен микроб гостоприемник 28, 23–30 (2020).

Birkholz, N., Fagerlund, R. D., Smith, L. M., Jackson, S. A. & amp Fineran, P. C. Авторегулаторът Aca2 медиира анти-CRISPR репресия. Нуклеинови киселини Res. 47, 9658–9665 (2019).

Stanley, S.Y. et al. Анти-CRISPR-свързаните протеини са решаващи репресори на анти-CRISPR транскрипцията. клетка 178, 1452–1464 e1413 (2019).

Watters, K.E. et al. Мощни инхибитори на CRISPR-Cas9 от геноми на Staphylococcus. Proc. Натл акад. Sci. САЩ 117, 6531–6539 (2020).

Harrington, L.B. et al. Широкоспектърен инхибитор на CRISPR-Cas9. клетка 170, 1224–1233 e1215 (2017).

I Jiang, F. et al. Чувствително на температурата конкурентно инхибиране на CRISPR-Cas9. Mol. клетка 73, 601–610 e605 (2019).

Liu, L., Yin, M., Wang, M. & Wang, Y. Phage AcrIIA2 ДНК мимикрия: структурна основа на надпреварата във въоръжаването на CRISPR и анти-CRISPR. Mol. клетка 73, 611–620 e613 (2019).

Dong et al. Структурна основа на инхибирането на CRISPR-SpyCas9 от анти-CRISPR протеин. природата 546, 436–439 (2017).

Yang, H. & Patel, D.J. Механизъм на инхибиране на анти-CRISPR супресор AcrIIA4, насочен към SpyCas9. Mol. клетка 67, 117–127 e115 (2017). Dong et al. (2017) и Янг и Пател (2017) представят първите структури на анти-CRISPR, свързани с Cas ефекторни комплекси, като по този начин предоставят механистична представа за това как функционират анти-CRISPRs.

Shin, J. et al. Деактивиране на Cas9 чрез анти-CRISPR ДНК имитация. Sci. адв. 3, e1701620 (2017). Тази статия показва, че доставката на анти-CRISPR във времето намалява редактирането извън целта в човешките клетки.

Kim, I. et al. Структура и динамика на разтвора на анти-CRISPR AcrIIA4, инхибитора на Cas9. Sci. представител 8, 3883 (2018).

Rauch, B.J. et al. Инхибиране на CRISPR-Cas9 с бактериофагови протеини. клетка 168, 150–158 e110 (2017).

Fuchsbauer, O. et al. Алостерично инхибиране на Cas9 от анти-CRISPR протеин AcrIIA6. Mol. клетка 76, 922–937 e927 (2019).

Hynes, A.P. et al. Широко разпространените анти-CRISPR протеини във вирулентни бактериофаги инхибират редица Cas9 протеини. Нац. комун. 9, 2919 (2018).

Lee, J. et al. Мощно инхибиране на Cas9 в бактериални и човешки клетки от AcrIIC4 и AcrIIC5 анти-CRISPR протеини. mBio 9, e02321-18 (2018).

Sun, W. et al. Структури на Neisseria meningitidis Cas9 комплекси в каталитично стабилни и анти-CRISPR-инхибирани състояния. Mol. клетка 76, 938–952 e935 (2019).

Kim, Y. et al. Anti-CRISPR AcrIIC3 разграничава Cas9 ортолози чрез насочване към променливата повърхност на HNH нуклеазния домен. FEBS Дж. 286, 4661–4674 (2019).

Forsberg, K. J. et al. Функционално ръководено от метагеномика откриване на мощни инхибитори на Cas9 в човешкия микробиом. eLife 8, e46540 (2019).

Varble, A. et al. Интегрирането на профаги в CRISPR локуси ремоделира вирусния имунитет в Streptococcus pyogenes. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.10.09.333658 (2020).

Песен, G. et al. AcrIIA5 инхибира широк спектър от ортолози Cas9, като предотвратява разцепването на ДНК прицел. клетъчен представител 29, 2579–2589 e2574 (2019).

Garcia, B. et al. Anti-CRISPR AcrIIA5 мощно инхибира всички Cas9 хомолози, използвани за редактиране на генома. клетъчен представител 29, 1739–1746 e1735 (2019).

An, S.Y. et al. Вътрешното разстройство е от съществено значение за инхибирането на Cas9 на анти-CRISPR AcrIIA5. Нуклеинови киселини Res. 48, 7584–7594 (2020).

Forsberg, K. J. et al. AcrIIA22 е нов анти-CRISPR, който нарушава активността на SpyCas9 чрез облекчаване на усукването на ДНК на целевите плазмиди. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.09.28.317578 (2020).

Yan, W. X. et al. Функционално разнообразни системи тип V CRISPR-Cas. наука 363, 88–91 (2019).

Zetsche, B. et al. Cpf1 е единична РНК-управлявана ендонуклеаза от клас 2 CRISPR-Cas система. клетка 163, 759–771 (2015).

Swarts, D. C. & amp Jinek, M. Механистични прозрения в цис- и транс-действащите ДНК-азни дейности на Cas12a. Mol. клетка 73, 589–600 e584 (2019).

Dong, D. et al. Кристалната структура на Cpf1 в комплекс с CRISPR РНК. природата 532, 522–526 (2016).

Yamano, T. et al. Кристална структура на Cpf1 в комплекс с водеща РНК и целева ДНК. клетка 165, 949–962 (2016).

Garcia-Doval, C. & Jinek, M. Молекулни архитектури и механизми на клас 2 CRISPR-асоциирани нуклеази. Curr. Opin. Структура. Biol. 47, 157–166 (2017).

Gao, P., Yang, H., Rajashankar, K. R., Huang, Z. & Patel, D. J. Тип V CRISPR-Cas Cpf1 ендонуклеазата използва уникален механизъм за crRNA-медиирано разпознаване на целевата ДНК. Cell Res. 26, 901–913 (2016).

Watters, K.E., Fellmann, C., Bai, H.B., Ren, S.M. & Doudna, J.A. Систематично откритие на естествени инхибитори на CRISPR-Cas12a. наука 362, 236–239 (2018).

Marino, N.D. et al. Откриване на широко разпространени инхибитори на CRISPR-Cas тип I и тип V. наука 362, 240–242 (2018).

Knott, G.J. et al. Широкоспектърно ензимно инхибиране на CRISPR-Cas12a. Нац. Структура. Mol. Biol. 26, 315–321 (2019). Тази статия описва анти-CRISPR, който разгражда crRNA.

Zhang, H. et al. Структурна основа за инхибиране на CRISPR-Cas12a от анти-CRISPR протеини. Клетъчен микроб гостоприемник 25, 815–826 e814 (2019).

Dong, L. et al. Анти-CRISPR протеин деактивира тип V Cas12a чрез ацетилиране. Нац. Структура. Mol. Biol. 26, 308–314 (2019). Тази статия описва анти-CRISPR, който ацетилира остатъка Lys635 на Cas12.

Knott, G.J. et al. Структурна основа за инхибиране на AcrVA4 на специфичен CRISPR-Cas12a. eLife 8, e49110 (2019).

Peng, R. et al. Структурен поглед върху многоетапното инхибиране на CRISPR-Cas12a от AcrVA4. Proc. Натл акад. Sci. САЩ 116, 18928–18936 (2019).

Abudayyeh, O.O. et al. C2c2 е еднокомпонентен програмируем РНК-управляван CRISPR ефектор, насочен към РНК. наука 353, aaf5573 (2016).

Liu, L. et al. Молекулната архитектура за РНК-управлявано РНК разцепване от Cas13a. клетка 170, 714–726 e710 (2017).

Meeske, A. J., Nakandakari-Higa, S. & amp Marraffini, L. A. Cas13-индуцираната клетъчна латентност предотвратява нарастването на CRISPR-резистентен бактериофаг. природата 570, 241–245 (2019).

Meeske, A.J. et al. Кодиран с фаг анти-CRISPR позволява пълно избягване на имунитета от тип VI-A CRISPR-Cas. наука 369, 54–59 (2020). Тази статия предоставя първите подробни молекулярни механизми на анти-CRISPR, насочени към тип VI CRISPR-Cas системи, свързани с пълното избягване на имунитета на CRISPR-Cas13.

Lin, P. et al. Инхибиторите на CRISPR-Cas13 блокират редактирането на РНК в бактерии и клетки на бозайници. Mol. клетка 78, 850–861 (2020).

Aschenbrenner, S. et al. Свързването на Cas9 с изкуствени инхибиторни домени повишава специфичността на CRISPR-Cas9 прицел. Sci. адв. 6, eaay0187 (2020).

Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Програмируемо редактиране на целева база в геномна ДНК без двойно-верижно ДНК разцепване. природата 533, 420–424 (2016).

Zuo, E. et al. Редакторът на базата на цитозин генерира значителни нецелеви еднонуклеотидни варианти в миши ембриони. наука 364, 289–292 (2019).

Jin, S. et al. Основните редактори на цитозин, но не и на аденин предизвикват мутации извън целта в целия геном в ориза. наука 364, 292–295 (2019).

Liang, M. et al. AcrIIA5 потиска основните редактори и намалява ефектите им извън целта. клетки 9, 1786 (2020).

Hoffmann, M.D. et al. Клетъчно-специфично активиране на CRISPR-Cas9 чрез микроРНК-зависима експресия на анти-CRISPR протеини. Нуклеинови киселини Res. 47, e75 (2019).

Hirosawa, M., Fujita, Y. & amp Saito, H. Специфично за клетъчен тип CRISPR активиране с микроРНК-отзивчив превключвател AcrllA4. ACS Synth. Biol. 8, 1575–1582 (2019).

Lee, J. et al. Редактиране на геном с ограничена тъкан in vivo, определено от микроРНК-репресивни анти-CRISPR протеини. РНК 25, 1421–1431 (2019).

Palmer, D. J., Turner, D. L. & amp Ng, P. Производство на CRISPR/Cas9-медиирани саморазцепващи се хелпер-зависими аденовируси. Mol. Тер. Методи Clin. Разв. 13, 432–439 (2019).

Gantz, V.M. et al. Високоефективен Cas9-медииран генен двигател за модифициране на популацията на комар с малариен вектор Анофелес Стефанси. Proc. Натл акад. Sci. САЩ 112, E6736–E6743 (2015).

Kyrou, K. et al. Генен диск CRISPR-Cas9, насочен към двоен секс, причинява пълно потискане на популацията в клетка Anopheles gambiae комари. Нац. Биотехнология. 36, 1062–1066 (2018).

Champer, J. et al. Молекулярна защита на експериментите с генно задвижване CRISPR. eLife 8, e41439 (2019).

Basgall, E.M. et al. Инхибиране на генно задвижване от анти-CRISPR протеините AcrIIA2 и AcrIIA4 in Saccharomyces cerevisiae. микробиология 164, 464–474 (2018).

Li, J., Xu, Z., Chupalov, A. & Marchisio, M.A. Анти-CRISPR-базирани биосензори в дрождите S. cerevisiae. J. Biol. инж. 12, 11 (2018).

Nakamura, M. et al. Анти-CRISPR-медииран контрол на редактиране на гени и синтетични вериги в еукариотни клетки. Нац. комун. 10, 194 (2019).

Liu, X.S. et al. Спасяване на неврони със синдром на крехък Х чрез редактиране на ДНК метилиране на гена FMR1. клетка 172, 979–992 e976 (2018).

Luo, M.L., Mullis, A.S., Leenay, R.T. & Beisel, C.L. Повторно предназначение на ендогенни CRISPR-Cas системи от тип I за програмируема генна репресия. Нуклеинови киселини Res. 43, 674–681 (2015).

Bubeck, F. et al. Създадени анти-CRISPR протеини за оптогенетичен контрол на CRISPR-Cas9. Нац. Методи 15, 924–927 (2018).

Johnston, R.K. et al. Използване на анти-CRISPR протеин AcrIIA4 като улавящ лиганд за откриване на CRISPR/Cas9. Biosens. Биоелектрон. 141, 111361 (2019).

Phaneuf, C.R. et al. Ултрачувствително многовидово откриване на CRISPR-Cas9 чрез преносима центробежна микрофлуидна платформа. анален. Методи 11, 559–565 (2019).

Nobrega, F. L., Costa, A. R., Kluskens, L. D. & amp Azeredo, J. Преразглеждане на фаговата терапия: нови приложения за стари ресурси. Тенденции Microbiol. 23, 185–191 (2015).

Smargon, A.A. et al. Cas13b е тип VI-B CRISPR-свързана РНК-управлявана РНКаза, диференциално регулирана от спомагателни протеини Csx27 и Csx28. Mol. клетка 65, 618–630 e617 (2017).

Danna, K. & Nathans, D. Специфично разцепване на ДНК 40 на маймунски вирус чрез рестрикционна ендонуклеаза на hemophilus influenzae. Proc. Натл акад. Sci. САЩ 68, 2913–2917 (1971).


Към DSB или не към DSB

Разчитането на HDR за редактиране рискува от въвеждане на индели или хромозомни транслокации. Дори с точно насочена нуклеаза, с HDR, „вие сте на милостта на клетката“, отбелязва Стодард. За редактиране без непредсказуемостта на HDR, добавя той, следете за развитието на специфичните за сайта рекомбинази (SSR).

„SSRs правят цялото нещо“, казва Маршал Старк, молекулярна генетика в Университет на Глазгоу в Шотландия. "Те се счупват и се присъединяват отново към ДНК без нужда от фактори на гостоприемника." Дори в клетки с нисък или никакъв HDR, SSRs могат да интегрират екзогенна ДНК в целево място. При оптимални условия, казва Старк, "SSR могат да бъдат изключително ефективни, като рекомбинацията се приближава до 100% за няколко минути." SSR могат да правят промени, подобни на превключватели, като например обръщане на ориентацията на сегмента на ДНК. Това ги прави ценни за създаване на пътища, подобни на електронни вериги, които контролират поведението на клетките за промишлени цели или приложения за синтетична биология, като например производството на биокомпютри. Въпреки това, SSR имат сложни, редки, целеви сайтове с 30 до 50 базови двойки.

Старк назовава два подхода за адаптиране на SSR за по-широко разпространено редактиране на генома: (1) използване на насочена еволюция, която избира за нови целеви специфики и (2) създаване на слети протеини. Например, той и други прикрепват SSR-получени рекомбиназни домени към модули с цинков пръст, които свързват специфични ДНК последователности. Технологията е „все още на ниво разследване“, отбелязва Старк. „Ако имате предвид конкретна цел, все още е много работа да се направи рекомбиназа за нея.“

За редактиране на генома без DSBs, изследователите използват Cas9, който все още се насочва от gRNA, но не разрязва ДНК или прави само едноверижни прорези. Вариантите на Cas9 са слети с транскрипционни активатори или репресори, или с ензими, които променят структурата на хроматина чрез модифициране на ДНК или ДНК-опаковащи хистонови протеини, за да променят генната експресия. Това редактиране на епигенома прилича на естествена генна регулация, казва Герсбах, „без риск от нецелеви промени в ДНК последователностите“. Методът е основен изследователски инструмент за изучаване на епигенетиката и има потенциални терапевтични приложения, като реактивиране на заглушения ген, който причинява синдрома на крехкия X на интелектуалното увреждане (4).

Редактирането на базата прави промени с единична база, като същевременно избягва неволни мутации от ремонт на DSB. Работи в клетки без HDR. Иновациите в този метод се публикуват редовно, но първите основни редактори, разработени от групата на Дейвид Лиу, са Харвардския университет имаше инвалидизиран Cas9, насочен към ДНК последователност, слята с ензим, който превръща цитозин в урацил. Слетият протеин променя двойката цитозин-гуанин в тимин-аденин. Друг основен редактор, който лабораторията на Лиу генерира чрез протеиново инженерство и насочена еволюция, променя аденин-тимин в гуанин-цитозин. Само тези две системи за редактиране на бази могат да направят една трета от всички възможни промени в базовите двойки, твърди Лиу, и потенциално да коригират 62% от известните патогенни точкови мутации при човека.

Към лятото на 2019 г. повече от 100 изследователски статии описват експерименти, използващи базово редактиране, казва Лиу, „включително няколко, които коригират животински модели на човешки генетични заболявания чрез директно обръщане на точкови мутации“. Например, един редактор коригира мутация, която причинява фенилкетонурия (5). Лиу и други диверсифицират редактирането на базата - разширяват опциите за промяна на базата, увеличават специфичността и подобряват активността при живи животни и в целевите места, които изискват разграничаване между много сходни последователности.


Клинични проучвания на CRISPR: Актуализация за 2021 г

2020 беше голяма година за CRISPR и откритията на нови Cas протеини, използването на технологията CRISPR за изследване и разработване на диагностични тестове на COVID-19, Нобелова награда и др. Изминалата година също донесе резултати от клинични изпитвания с помощта на технологията CRISPR, за които за първи път съобщихме през 2019 г., и началото на нови клинични изпитвания.

В тази нова статия за преглед ще разгледаме основите на клиничните изпитвания и след това ще начертаем текущите базирани на CRISPR проучвания от фона на заболяването до това, което наистина се надяваме да научим от тези проучвания.

ОСНОВИ НА КЛИНИЧНОТО ИЗПИТВАНЕ

В Съединените щати Агенцията по храните и лекарствата (FDA) оценява новите лечения на болести за безопасност и ефикасност чрез клинични изпитвания върху пациенти доброволци. Ранните проучвания разглеждат безопасността и страничните ефекти. По-късни проучвания тестват ефикасността и сравняват новите терапии със стандартните лечения.

Настоящите проучвания, използващи базирани на CRISPR лечения, са все още в ранен етап. Това означава, че дори ако леченията са безопасни и ефективни, те вероятно са още няколко години от одобрението на FDA и ще бъдат широко достъпни за пациентите.

Появата на технологията CRISPR отваря нови възможности в прецизната медицина. Текущи изпитвания се провеждат в пет области на лечение: заболявания на кръвта, рак, очни заболявания, хронични инфекции и нарушения на сгъването на протеини. Всички текущи клинични проучвания на CRISPR са предназначени да редактират специфични клетки или тъкани, без да засягат сперматозоидите или яйцеклетките, което означава, че никакви промени в ДНК не могат да бъдат предадени на бъдещите поколения.

КРЪВНИ НАРУШЕНИЯ

ФОН ЗА ЗАБОЛЯВАНЕ

Червените кръвни клетки използват хемоглобина, за да пренасят кислород от белите дробове до всички тъкани на тялото. Мутацията в ген, който кодира част от молекулата на хемоглобина, причинява две различни генетични заболявания: сърповидно-клетъчна болест (SCD) и бета таласемия.

При сърповидно-клетъчна болест (SCD) червените кръвни клетки са деформирани. Тяхната форма на полумесец или "сърп" ги кара да блокират кръвоносните съдове, забавяйки или спирайки притока на кръв. Това причинява внезапна, силна болка. Усложненията включват хронична болка, увреждане на органи, инсулти и анемия. При бета таласемия пациентите не произвеждат достатъчно хемоглобин. Това води до анемия и умора. В по-тежки случаи пациентите имат органни увреждания, особено черния дроб, костите и сърцето. И двете заболявания могат да бъдат фатални.

Съществуват някои лечения, но често пациентите все още страдат от тежки симптоми и усложнения от своите заболявания. Пациентите с по-тежки SCD и бета таласемия се нуждаят от чести кръвопреливания. Трансплантацията на костен мозък може да бъде лечебна, но това може да се направи само когато може да бъде намерен здрав, съответстващ донор. Това не е опция за повечето пациенти с SCD или бета таласемия.

СТРАТЕГИИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ

Подходът, възприет за лечение на заболявания на кръвта с технологията CRISPR, не фиксира директно генните варианти, които причиняват заболяване, но използва умно решение: вместо директно фиксиране на мутациите, причиняващи болестта, целта е да се повишат нивата на феталния хемоглобин. Това е форма на хемоглобин, който фетусите произвеждат в утробата, но децата и възрастните не произвеждат. Не е напълно разбрано защо хората преминават от една форма на хемоглобин към друга, но феталният хемоглобин може да заеме мястото на дефектния хемоглобин за възрастни в червените кръвни клетки. Това лечение може да се използва за лечение както на бета таласемия, така и на SCD.

При пациенти с SCD симптомите започват да се проявяват след намаляване на нивата на феталния хемоглобин (HbF).

Първата стъпка от лечението е да се съберат кръвни стволови клетки на пациента от кръвта му. След това учените редактират генома на тези клетки. След това химиотерапията елиминира дефектните кръвни стволови клетки в тялото на пациента и милиарди редактирани от генома стволови клетки се връщат обратно в кръвния им поток. Генно-редактираните кръвни стволови клетки се доставят от IV. Ако този подход работи по предназначение, тези клетки ще се установят и ще създадат нова популация от кръвни стволови клетки в костния мозък, което ще направи редактирани червени кръвни клетки, които произвеждат фетален хемоглобин.

Този подход на лечение се счита за редактиране на генома ex vivo, тъй като редактирането се извършва извън тялото на пациента. Ех vivo редактирането гарантира, че инструментите за редактиране на генома влизат в контакт само с правилните целеви клетки.

ТЕКУЩИ КЛИНИЧНИ ИЗПИТВАНИЯ CRISPR

При първото използване на ex vivo базирана на CRISPR терапия за лечение на генетично заболяване, изследователите лекуваха пациент с бета таласемия в Германия през февруари 2019 г. Оттогава са лекувани още 12 пациенти, а седем от тях са проследени за поне трима месеци. Нито един от пациентите не се нуждаеше от кръвопреливане през месеците след лечението. Първият пациент с SCD беше лекуван със същата терапия в Нашвил, Тенеси през юли 2019 г. Този пациент, Виктория Грей, показа забележителен напредък. Чуйте от самата Грей. Ранните резултати при други пациенти също са обещаващи:

  • Всички пациенти, лекувани за SCD или бета таласемия, показват нормални до почти нормални нива на хемоглобина, където най-малко 30% (SCD) или 40% (бета таласемия) от хемоглобина е фетален хемоглобин.
  • В проби от костен мозък, взети от Грей, допълнителен пациент с SCD, и пет пациенти с бета таласемия, изследователите откриха клетки с очакваната генетична промяна, която им позволява да произвеждат фетален хемоглобин. Това показва, че редактираните клетки успешно са се настанили в костния мозък.
  • Единствените непосредствени странични ефекти, свързани с лечението, са резултат от прилагането на химиотерапия.
  • Прочетете още:
      &mdash Frangoul et al., New England Journal of Medicine &mdash Резюме от Frangoul et al. в Американското дружество по хематология
  • CRISPR Therapeutics и Vertex Pharmaceuticals провеждат съвместно изпитанията на феталния хемоглобин и набират пациенти в САЩ, Канада и Европа.

    Предстоящо проучване от UCSF, UCLA и UC Berkeley, включително изследователи на IGI, планира да тества алтернативен подход, който директно да поправи мутацията, която причинява SCD.

    КАКВО ДА ВНИМАВАТЕ

    В момента има избухване на изследвания за лечение на заболявания на кръвта. Фармацевтични и биотехнологични компании, както и академични изследователски институции работят както върху фармацевтичните, така и върху генетичните терапии. Все още не знаем кои подходи ще бъдат най-безопасните и ефективни, но пациентите със сигурност ще се възползват от повишената изследователска активност в тези области на заболяването.

    Първоначалните резултати от Виктория Грей и други пациенти-доброволци са изключително обнадеждаващи. Очакваме по-подробни резултати от други участници в изпитването, които се надяваме да покажат подобно намаляване на симптомите. Дългосрочното проследяване на Грей и други пациенти е от решаващо значение: те ще бъдат проследявани в продължение на години, за да се види дали лечението остава ефективно и да се търсят потенциални странични ефекти, като отрицателни последици за здравето или рак от нежелани или извън целта редакции, които печелят&rsquot да бъдат очевидни до по-нататък.

    &ldquoОсновните странични ефекти досега са били от химиотерапията, необходима за унищожаване на вече съществуващите клетки от костен мозък, за да могат редактираните клетки да се присадят. Химиотерапията е огромен ограничаващ фактор за тези терапии,&rdquo обяснява д-р Меган Хохстрасер, експерт по CRISPR, който е учил с Дженифър Дудна и сега служи като мениджър на образователната програма на IGI. &ldquoАко ви се налага да сте в болница със седмици, защото ви аблират костния мозък с химиотерапия, която осакатява имунната ви система, това&rsquo е рисковано, скъпо и отнема много време. Това&rsquos огромна бариера за мащабирането и предоставянето му на широко разпространение. Това&rsquos е голямо препятствие, което може да бъде преодоляно, ако някой намери начин да проведе лечението директно, без аблация на костен мозък.&rdquo

    Мащабируемост &mdash получаването на лечението на много хора, които се нуждаят от него &mdash ще бъде голямо предизвикателство, ако лечението премине напред към одобрение от FDA, както поради техническите предизвикателства при създаването на индивидуализирания продукт и администрирането на протокола за лечение, така и поради разходите. Изследванията на in vivo подходи, които биха могли да премахнат необходимостта от химиотерапия и да намалят свързаните рискове и разходи, са в ранен етап, но ще бъдат в центъра на вниманието на тези, които работят за по-широко достъпни терапии, базирани на CRISPR за кръвни заболявания през следващите години. .

    РАК

    ФОН НА БОЛЕСТ

    Ракът се отнася до група заболявания, причинени от неконтролиран клетъчен растеж. В момента терапиите, базирани на CRISPR, са насочени главно към лечение на рак на кръвта като левкемия и лимфом. Наскоро приключи и изпитание в Китай за вид рак на белия дроб.

    СТРАТЕГИЯ ЗА ЛЕЧЕНИЕ

    Т-клетките, вид бели кръвни клетки, необходими за отговора на имунната система, са покрити с рецептори, които разпознават други клетки като безопасни или заплашителни. Те патрулират тялото, убивайки чужди или опасни клетки или набирайки други клетки за помощ. В имунотерапията с CAR-T изследователите генетично проектират Т-клетките на пациента, за да имат рецептор, който разпознава раковите клетки на пациента и казва на Т-клетките да атакуват. Имунната система е силно регулирана, за да се избегне атака на здрави клетки. Някои Т клетъчни рецептори работят като &ldquocheckpoints&rdquo, които определят дали възниква имунен отговор. Когато Т-клетъчен PD-1 рецептор влезе в контакт с молекула, наречена PD-L1 на друга клетка, той съобщава, че е &ldquosafe&rdquo клетка и Т-клетката я оставя сама.

    Раковите клетки често са прикрити в тези молекулярни сигнали за безопасност, подмамвайки патрулиращите Т клетки да ги игнорират. Изследователите използват CRISPR, за да редактират гена PD-1 в Т клетките, за да ги спрат да произвеждат функционални PD-1 рецептори, така че да могат да бъдат заблудени от раковите клетки. Този имунотерапевтичен подход е известен като инхибиране на контролни точки и често се използва във връзка с CAR-T инженерството, за да даде на Т клетките възможно най-големия шанс за елиминиране на рака.

    За тези лечения изследователите събират Т клетки от кръвта на пациент и ги конструират в лаборатория. След това ги връщат обратно в кръвния поток на пациента до IV. Тъй като това лечение разчита на ex vivo редактиране, е лесно да се доставят инструментите за редактиране на генома на целевите клетки. CAR-T терапията беше одобрена за използване при лечение на рак на кръвта през 2017 г.

    ТЕКУЩИ КЛИНИЧНИ ИЗПИТВАНИЯ CRISPR

    През 2016 г. пациент с рак на белия дроб стана първият човек в света, лекуван с CRISPR терапия: този пациент беше инжектиран с редактирани от PD-1 Т-клетки в китайско клинично изпитване. Това и американско клинично изпитване с използване на базирани на CRISPR имунотерапии за рак са завършени. Няколко други клинични проучвания, използващи базирани на CRISPR имунотерапии, главно за лечение на рак на кръвта, са в ход.

    В китайското проучване изследователи от болницата в Западен Китай, университета в Съчуан са лекували 12 пациенти с недребноклетъчен рак на белия дроб с редактирани от PD-1 Т-клетки. Този подход не включва CAR-T, тъй като в момента не е опция за рак на белия дроб. Основните цели на това проучване бяха да се провери дали лечението е безопасно, има поносими странични ефекти и дали предизвиква опасен имунен отговор.

    През април 2020 г. резултатите от това проучване бяха публикувани в Природна медицина. Отчетените констатации включват:

    • Лечението беше безопасно за прилагане и имаше приемливи странични ефекти като треска, обрив и умора.
    • Желаната редакция е намерена в медиана от 6% от Т клетките/пациент преди инфузията обратно в пациента.
    • Ефекти извън целта &mdash нежелани промени на различни места в генома &mdash се наблюдават с ниска честота и са предимно в части от генома, които не кодират протеини. Ефекти върху целта &mdash нежеланите промени в целевото място &mdash са по-чести (медиана от 1,69%).
    • Редактирани Т-клетки са открити при 11 от 12 пациенти два месеца след инфузията, макар и на ниски нива. Пациентите с по-високи нива на редактирани клетки са имали по-малко прогресия на заболяването.
    • Прочетете още:
        &mdash Ю и др., Природна медицина &mdash Lacey & Fraietta, Тенденции в молекулярната медицина
    • Първото базирано на CRISPR терапевтично проучване в САЩ комбинира имунотерапевтични подходи CAR-T и PD-1, използвайки CRISPR за редактиране на общо три гена. Това проучване от фаза 1, проведено от Университета на Пенсилвания съвместно с Института Паркър, започна да набира персонал през 2018 г. и беше завършено през февруари 2020 г. Подобно на китайското проучване, целите бяха да се определи дали лечението е безопасно и има приемливи странични ефекти , а не да лекува пациенти. Двама пациенти доброволци с напреднал рак на белите кръвни клетки (миелом) и един с метастатичен рак на костите (сарком) бяха лекувани. Отчетените констатации са:

      • Лечението беше безопасно за прилагане и имаше приемливи странични ефекти.
      • Т-клетките се настаняват в костния мозък и остават на стабилни нива за деветте месеца на изследването.
      • Туморните биопсии показват, че Т-клетките са в състояние да открият и инфилтрират тумори.
      • Неприцелните ефекти са наблюдавани рядко. Но нежелани промени в целевото място се наблюдават често, като 70% от клетките показват поне една мутация на или близо до целевото място по време на производството. След инфузия и с течение на времето при пациентите процентът на клетките с мутации намалява.
      • Прочетете още:
          &mdash Stadtmauer et al., наука
      • Заедно тези проучвания показват, че CRISPR-инженерната CAR-T терапия може да бъде обещаваща линия на лечение: тя е безопасна, страничните ефекти са поносими и лечението не предизвиква силна имунна реакция.

        Нито едно лечение не осигури лечение, но целта на тези проучвания беше само да се види дали лечението е безопасно и трябва да се развива допълнително за лечение, а не за лечение на болестта. Като първи опити и двата опита постигнаха целите си да покажат безопасност и поносимост.

        &ldquoНаистина интересно нещо е, че американското проучване показа процент от големите геномни пренареждания, от които хората се страхуват,&rdquo казва Хохстрасер. &ldquoНо процентът клетки с тези промени всъщност намалява с времето. Изглеждаше, че клетките, които имат тези видове мутации, умират или се конкурират от другите клетки. Така че изглеждаше, че клетките, които не&rsquot не искате в тялото, всъщност не се задържаха в тялото, което беше изненада за мен и много окуражаващо.&rdquo

        КАКВО ДА ВНИМАВАТЕ

        FDA вече одобри CAR-T терапии и инхибитори на пътя на PD-1, които не използват редактиране на генома. Това е причина за оптимизъм: работата по доказване на принципите за тези терапии вече е извършена успешно.

        Според Hochstrasser, &ldquoЕфективността на редактирането &mdash означава, процентът клетки, които действително са получили редакции &mdash, не е бил голям в нито един от опитите. Но тези опити бяха одобрени преди години и бяха извършени с помощта на технология от 2016 г. Оттогава има много напредък в технологията. И така, това е важно доказателство за концепцията за непосредствената безопасност и поносимост на лечението и ние&rsquoll трябва да видим дали те могат да увеличат ефективността на редактиране.&rdquo

        Използвайки наличните, по-мощни техники, ефективността на редактирането ще бъде ли по-висока? И с по-висока ефективност на редактиране, генетичното инхибиране на контролните точки ще работи ли също така или по-добре от лекарствата, блокиращи контролните точки? Ще бъде ли редактирането на PD-1 толкова или по-ефективно от лечението с антитела, които деактивират PD-1? Бъдещите изследвания ще трябва да отговорят на тези въпроси.

        За пълния преглед на клиничните изпитвания на CRISPR, които се провеждат през 2021 г., обхващащи очни заболявания, хронична инфекция, рядко заболяване на сгъване на протеини и какво да търсите от базираните на CRISPR терапевтици, моля, вижте пълната статия от Института за иновативна геномика.

        от Хоуп Хендерсън, Институт за иновативна геномика, март 2021 г


        Резултати

        CRISPR като вероятностна памет за фаг.

        Разглеждаме модел на инфекция, при който бактериите срещат j = 1, …, K видове фаги, всеки с вероятност f j . За простота се приема, че всички видове фаги са еднакво инфекциозни и имат сходни темпове на растеж, условия, които лесно се облекчават. В механизма CRISPR за адаптивен имунитет, бактериите включват фрагменти от фагова ДНК (спейсъри) в CRISPR касета. При по-късна инфекция, бактериите набират CRISPR-Cas комплекси със спейсери, които съответстват на нахлуващия фаг, за да разцепят вирусната ДНК (фиг. 1).

        CRISPR имунитет при бактерии. Бактерия (ограничен правоъгълник) с CRISPR машина се сблъсква с разнообразен набор от фаги (цветове). CRISPR-Cas локусът се транскрибира и след това се обработва за свързване на Cas протеини (сиви овали) с отделни разделители (цветове), като по този начин се произвеждат CRISPR-Cas комплекси. Комплексът със спейсер, който е специфичен за инжектираната фагова ДНК (същия цвят) може да разгради вирусния материал и да предпази бактерията от инфекция.

        Да предположим, че касетите CRISPR съдържат общо L спейсери и че отделна бактерия поддържа популация от N p Cas протеинови комплекси, които могат да бъдат наети за разцепване на нашественици. Конфигурацията на спейсера може да се характеризира като вектор s = < s 1 ⋯ s K > с записи, отчитащи броя на спейсерите, специфични за всеки тип фаг. Общият размер на касетата е сумата от s j , т.е. ∑ j s j = L , и определя количествено количеството имунна памет, съхранявана от отделна бактерия. Ние описваме фаговата конфигурация в дадено инфекциозно събитие като вектор v с дължина K с записи, показващи присъствие (1) или отсъствие (0) на всеки вирусен тип. И накрая, ние дефинираме конфигурацията на комплексите d = < d 1 ⋯ d K >като вектор с записи, отчитащи броя на комплексите, специфични за всеки фаг по време на отговора на CRISPR. Общият брой на комплексите е сумата от d j , т.е. ∑ j d j = N p . По отношение на тези променливи, вероятността за оцеляване при фагова инфекция с помощта на защитния механизъм CRISPR-Cas е P оцеляване = 1 − ∑ vp V ( v ) ∑ s 1 + s 2 + ⋯ = L p S ( s ∣ L ) × ∑ d 1 + d 2 + ⋯ = N p 1 − α ( v , d ) q ( d ∣ s ) . [1] Тук p V ( v ) е вероятността да се срещне фаговата конфигурация v, p S ( s ∣ L ) е вероятността да има конфигурация на касета s с дължина L, α ( v, d ) е вероятността за откриване всички вирусни типове, присъстващи във v, като се има предвид конфигурацията d на комплексите, а q ( d ∣ s ) е вероятността да се произведе CRISPR-Cas конфигурация d, като се има предвид набора от спейсери s и N p Cas протеинови комплекси.

        Дори ако броят на фаговите типове надвишава броя на комплексите (K ≫ N p), бактериите могат да оцелеят, защото приемаме, че типичната инфекция включва само няколко вирусни типа (или дори само един). В този сценарий, заразяващ фаг ще атакува част от голяма бактериална популация. С касети, вземащи проби спейсери на случаен принцип, е вероятно поне някои атакувани индивиди да съдържат спейсери, специфични за фага и по този начин ще оцелеят. Вродените механизми също ще доведат до оцеляване на някои бактерии без специфични разделители, въпреки че ние не моделираме изрично този принос към имунитета. Оцелелите бактерии и индивидите, които не са били атакувани, ще се възпроизвеждат и поддържат популацията. В този контекст, когато пристигне следващата инфекция, касетите в бактериалната популация отново ще бъдат ефективно изтеглени на случаен принцип спрямо новата инфекция. Тоест, въпреки че касетите ще бъдат обогатени, за да отразяват предишната инфекция, повечето от разделителите все още ще бъдат разпределени на случаен принцип, така че касетите в различни отделни бактерии ще бъдат до голяма степен некорелирани. При многократни срещи циклите на обогатяване ще доведат до касети, отразяващи разпределението на фагите. Този сценарий би бил оспорен, ако фагите са много разнообразни (K > > N p), новите инфекции настъпват бързо (по-бързо от времената на бактериална репликация от 1/2 до 1 час) и инфекциите носят голям вирусен товар (спрямо размера на колонията) . В този случай бактериалната популация няма да има време да се уравновесява между атаките и може да се нуждае от други защитни механизми освен CRISPR, за да оцелее.

        Формата на функцията на вероятността за откриване α ( v , d ) зависи от специфичния механизъм, използван от машината CRISPR за свързване и разграждане на фаг. Въпреки това, критичен брой специфични комплекси, d c , е необходим, за да може машината CRISPR да постигне насочване при скорости, измерени в експерименти (32). Този критичен брой зависи имплицитно от размера на клетката, дифузионните константи, времевите мащаби на фаговата инфекция и разпознаването на целта и константите на дисоциация/асоциация между спейсери и протоспейсърни последователности. Под тази критична стойност откриването е по-малко вероятно, а над критичната стойност вероятността за откриване се увеличава.Разглеждаме две функционални форми за вероятността, че определен тип фаг може да бъде открит с d специфични комплекси: 1) твърдо ограничение α ( d ) = θ ( d − dc ) , където θ ( x ) е стъпаловидна функция и е 0, ако x < 0 и 1, ако x > 0, и 2) меко ограничение α ( d ) = dhdh + dch . И в двата случая d c е параметър за ефикасност, който зависи от биохимичните скорости и определя прага на d, под който откриването е рядко и над което откриването е често. Първата функционална форма (степенна функция) описва поведение, подобно на превключвател, при което комплексите се свързват с фаговата ДНК, ако надвишават определена концентрация d > d c . Втората форма имитира реакция, подобна на Хил, където шансът за свързване нараства постепенно с броя на комплексите. Тук позволяваме свързването на Cas комплекси със свързването на фагова ДНК да бъде съвместно. С увеличаването на кооперативността h поведението на свързване става все по-подобно на превключвател.

        В нашата рамка приемаме, че вграждането на спейсър се случва, когато инфектиращият фаг е дефектен или ако влезе в игра някакъв друг механизъм на имунитет. След това обмисляме последващата вероятност за оцеляване на фаги поради CRISPR-Cas машината, когато спейсерът вече е налице. Вероятността за оцеляване ще се увеличи, когато се включат и други форми на имунитет (напр. вроден имунитет и ефекти на кворума). Важно е, че CRISPR не е първата линия на защита и други антифагови механизми могат да предхождат или допълват системата CRISPR (33). Нетният ефект от тези допълнителни механизми може да бъде моделиран чрез включване на ненулева базова линия във функцията на вероятността за откриване α. По този начин, нашият модел описва по-нататъшното предимство за оцеляване, предоставено от наличието на CRISPR като дългосрочна памет на фаговия пейзаж. Поради това бактериалната популация не трябва да бъде застрашена от изчезване, дори ако приносът на CRISPR за оцеляването е сравнително малък.

        Има оптимално количество памет.

        В реалистични настройки можем да направим опростяващи предположения за общия модел в уравнение. 1. Например, можем да предположим, че успешните инфекции на бактерия от различни фаги се случват с малка вероятност и са независими. Разбира се, дадена бактерия може да бъде заразена от множество фаги през целия си живот. Тъй като вероятността една бактерия едновременно да срещне множество фаги е малка, приемаме, че срещите са последователни (т.е., векторът на вирусната конфигурация v има единичен ненулев запис).

        Второ, предполагаме, че линията на бактерията се сблъсква с много и различни типове фаги в продължение на няколко поколения, т.е. K ≫ 1 . Тъй като фагите мутират лесно, има тънкост за това какво определя тип. Ние използваме функционална дефиниция - тип фаг се дефинира от неговото специфично разпознаване от даден спейсер. Понякога, след като бактерията стане имунизирана срещу фаг, едноточкови мутации във вируса могат да доведат до избягали, които избягват разпознаването. По нашата дефиниция тези escapers са ефективно нов тип вирус, с който бактериалната популация трябва да се справя последователно при бъдещи инфекции (34 ⇓ ⇓ –37).

        Трето, приемаме, че спейсерите са равномерно взети от разпределението на фага във времето. С други думи, ние приемаме, че прокариотите улавят спейсери от фагите, когато се срещнат. Така че, ако срещнат различни вируси, те ще имат различни масиви и разпределението на фагите ще бъде естествено отразено в разпределението на спейсерите. Включването на такова разпределение е лесно, като се приеме, че вероятността p i да бъде включен спейсер е функция на вирусния тип i. Това разпределение обаче не е известно експериментално. Следователно, ние правим минимално предположение, че всички типове фаги са еднакво вероятни и се срещат с вероятност 1 / K. Това е консервативно предположение, тъй като бактериалната имунна памет дава най-малко предимство, когато е изправена пред безпристрастна (т.е. минимално информативна) фагова среда. Всъщност ние се фокусираме върху дългосрочните статистически характеристики на имунитета, а не върху краткосрочната коеволюционна надпревара във въоръжаването между бактерия и фаг.

        И накрая, приемаме, че срещите с фаги, от които се получават спейсери, се случват на случаен принцип. По този начин всеки спейсер в касетата CRISPR има вероятност 1 / K да бъде специфичен за даден фаг. Тъй като размерът на касетата е много по-малък от броя на вирусните типове ( L ≪ K ), следва също така, че касетата обикновено има един или никакви разделители, които могат да се насочат към конкретен тип фаг - с други думи, si = 0,1 ( но вижте по-долу за анализ, позволяващ множество спейсери от всеки фаг).

        Като цяло е вероятно разпределението на спейсерите да е по-равномерно от разпределението на фагите. Механично, след като прокариотът има спейсер, който работи добре за даден фаг, като се насочва към еволюционно запазен регион в неговия геном, ще има по-малко поводи в дългосрочен план за придобиване на много допълнителни спейсери от същия вирус, тъй като съществуващите защити работят, въпреки че в краткосрочен план насочването на CRISPR може да произведе дефектни фаги, които насърчават включване на допълнителни разделители. (Виж Приложение на SI за обсъждане на праймирането и ефектите на множество специфични спейсери.) При по-дълги времеви интервали е вероятно да бъдат включени спейсери от нови вируси, което води до разпределение на спейсерите, което е по-равномерно от разпределението на вирусите. От стратегическа гледна точка, след като има достатъчно ефективна защита срещу общи заплахи, статистически е по-ефективно останалите ресурси да се отделят предимно за редки заплахи. Всъщност, въпреки че явления като праймирането могат да доведат до придобиване на множество спейсери срещу даден вирус (23 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –30), няколко проучвания показват, че наличието само на няколко спейсера от даден тип фаг е до голяма степен достатъчно за неутрализиране на реинфекции (6, 8, 16 ⇓ ⇓ –19). Това означава, че разпределението на спейсерите трябва да бъде по-равномерно от разпределението на патогените – т.е., на редките инфекции трябва да се придава по-голяма тежест, отколкото е оправдано от тяхната честота, което отново предполага, че равномерното разпределение на спейсерите ще бъде разумно приближение. Подобни наблюдения бяха направени по отношение на адаптивната имунна система на гръбначните животни в справки. 38 и 39. Скринингът на RNA-seq в лабораторни условия показва променлива експресия на спейсери в CRISPR касети, обикновено придружена от постепенно намаляване от водещия край, въпреки че може да има вътрешни промотори, водещи до засилена експресия на дистални спейсери (12 ⇓ –14 ). Ние ще приближим тези спорадични модели на експресия като постоянна средна стойност в спейсерите, чиято експресия е достатъчно висока, за да изгради защита срещу фаги.

        Извличаме израз за вероятността да оцелеем при фагова инфекция, като се има предвид размера на касетата L, броя на Cas комплексите N p и разнообразието на фаговата популация K (Материали и методи и уравнение 3). В широк диапазон от параметри и за различни възможности за избор на функции за вероятност за откриване α ( v , d ) откриваме, че има оптимално количество памет, състояща се от няколко десетки разделители в касетата CRISPR, за да се увеличи максимално вероятността за оцеляване (фиг. 2 и Фиг. S1). Оптималното се получава, защото има компромис между количеството запаметена памет в касетите CRISPR и ефикасността, с която бактерията може да използва своите ограничени ресурси (т.е. Cas протеини), за да превърне паметта във функционален отговор. Ако касетата CRISPR е твърде малка, бактериите не помнят минали срещи с фаги достатъчно добре, за да се защитят от бъдещи инфекции. От друга страна, ако касетата е твърде голяма, Cas комплексите се свързват твърде рядко с правилния разделител, за да осигурят ефективен имунитет срещу конкретен нахлуващ вирус. Оптималното количество имунна памет (размер на касетата) трябва да се намира между тези две крайности, с подробности, които зависят от фаговото разнообразие, броя на Cas комплексите и функцията на вероятността за откриване α ( v , d ) (фиг. 2 и Материали и методи).

        Има оптимално количество имунна памет. Топлинната карта показва вероятността за оцеляване при фагова инфекция, оцеляване на P, като функция от размера на касетата и фаговото разнообразие с N p = 700 Cas комплекси. P оцеляването може да се интерпретира като частичен размер на популацията, който ще се запази след последователни фагови атаки, ако CRISPR е единственият защитен механизъм. Функцията на вероятността за откриване е стъпаловидна функция α ( d ) = θ ( d − d c ) с праг d c = 8 , което предполага, че откриването на фаг изисква най-малко d c комплекси, свързани със съответните разделители. За произволен брой типове фаги има оптимален размер на касетата. Вижте Фиг. S1 за различни възможности за избор на N p , d c и функционални форми за α.

        Оптималната памет зависи от фаговото разнообразие.

        Как оптималното количество CRISPR памет зависи от разнообразието от вирусни заплахи? Ако има относително малко видове фаги, оптималната стратегия за бактерията би била да поддържа ефективна памет за повечето заплахи и да съпостави вирусните варианти с касета, чийто размер нараства с вирусното разнообразие. Тази стратегия за съвпадение в крайна сметка ще се провали, тъй като разнообразието на фаговата популация се увеличава, ако броят на Cas протеини (N p ) е ограничен. Ние изследвахме този компромис чрез измерване на оптималния размер на касетата, докато променяхме вирусното разнообразие (K), като същевременно поддържахме CRISPR машината (N p и вероятността за откриване α (v, d)) фиксирана.

        За да характеризираме вирусното разнообразие, ние дефинирахме параметър κ = K / N p като съотношение на броя на фаговите типове (K) и броя на Cas комплексите (N p). Когато фаговото разнообразие е ниско ( κ ≤ 1 ), оптималното количество памет (броя на спейсерите в клетка) се увеличава сублинейно с вирусната хетерогенност (фиг. 3), приблизително като степенен закон. Когато вероятността за откриване α ( v , d ) е почти подобна на превключвател, оптималният размер на касетата се мащабира приблизително като L ∼ K (фиг. 3 А и Б аналитично извеждане за d c = 1 in Приложение на SI). Това означава, че когато вирусното разнообразие е ниско, обемът на паметта трябва да се увеличава с разнообразието, но всъщност е полезно да не се запазва спомен за всички предишни срещи с фаги. Забравянето на някои срещи ще позволи на бактерията да монтира по-силен отговор срещу бъдещи заплахи чрез ангажиране на по-голям брой комплекси на Cas за запомнените заплахи. Тази сублинейност в оптималното количество памет става по-силна, тъй като броят на фаг-специфичните CRISPR-Cas комплекси, необходими за ефективен отговор, d c , се увеличава.

        Оптималното количество имунна памет зависи от вирусното разнообразие. Панелите показват оптималния размер на касетата (L) спрямо броя на комплексите Cas (N p), параметризирани като λ = L / N p, като функция на вирусното разнообразие (K) спрямо броя на комплексите, параметризирани като κ = K/N стр. Ние разглеждаме CRISPR машини с различни функции на вероятността за откриване: (А) вероятност за откриване, подобна на превключвател със стъпаловидна функция α ( d ) = θ ( d − d c ) и по-гладък модел α ( d ) = d h / ( d h + d c h ) с (Б) h = 10, което води до почти подобна на превключвател вероятност за откриване и (° С) h = 2, което води до по-мек преход между ниска и висока вероятност за откриване. Тук d c е ефективен праг за броя на комплексите (d), необходими за откриване на фаги с висока вероятност.

        Когато фаговото разнообразие е високо ( κ > 1 ), оптималното количество памет зависи от механизма CRISPR чрез прага на отговор d c, но е независимо от вирусната хетерогенност, докато d c ≥ 2 (фиг. 3 вж. Приложение на SI за обсъждане на специалния случай d c = 1 ). В природата се очаква фагите да бъдат много разнообразни (K ≫ N p). По този начин, нашият модел прогнозира, че размерът на касетата на бактерия се определя от нивото на експресия на Cas комплекси N p и прага на откриване d c на конкретния CRISPR механизъм, който се използва от вида.

        Паметта се увеличава с ефикасност на откриване.

        Ефикасността на откриване зависи от два ключови параметъра: 1) прага на откриване d c и 2) броя на наличните Cas протеини N p . На фиг. 4 показваме, че оптималният размер на касетата за защита срещу разнообразна фагова популация ( κ = K / N p ≫ 1 ) намалява като степенен закон на прага на откриване ∼ ( dc / N p ) − β с експонента β ≃ 1 (Материали и методи). Това разпадане се случва, защото транскрибираните спейсери се конкурират за образуване на комплекси с Cas протеини, като по този начин наличието на по-различими спейсери ефективно намалява средния брой комплекси, които биха били специфични за всяка инфекция. По този начин, колкото по-малък е размерът на касетата, толкова по-вероятно е да се получат специфичните за dc комплекси, необходими за ефективен CRISPR отговор. Оптималният размер на касетата е компромис между това устройство за по-малко памет и устройството за защита, която обхваща патогенния пейзаж.

        Оптималното количество имунна памет зависи от прага на откриване. Фигурата показва оптималния размер на касетата спрямо броя на Cas протеини, λ = L / N p , като функция на прага за откриване на фаг, също спрямо броя на Cas протеините, d c / N p . Разглеждаме различни функционални форми на вероятността за откриване: (А) стъпаловидна функция с рязък праг на откриване α ( d ) = θ ( d − d c ) и (Б и ° С) Хил функции, α ( d ) = d h / ( d h + d c h ) , с h = 10 инча Б и h = 3 инча ° С. Приема се, че типовете фаги са 1000 пъти по-многобройни от броя на комплексите ( κ = K / N p = 1 000). (Вложки) Оптималният размер на касетата се скалира като L = C ( d c / N p ) − β в реалистичен диапазон от стойности за броя на комплексите и праговете за откриване на фаги в една бактериална клетка. Най-добрите пасвания са показани във всеки случай с (А) β = 0,9 и C ∼ 1 , (Б) β = 1 и C ≃ 0,7 и (° С) β = 1 и C ≃ 0,8 .

        Ако вероятността за откриване зависи рязко от броя на свързаните комплекси с праг d c (фиг. 4А), в първо приближение, по-малко от dc комплекси, свързани към специфичен дистанционер, са безполезни, тъй като откриването остава малко вероятно, а по-голямото от това число е загуба, тъй като не би подобрило откриването. В този случай, ако експресията на Cas протеина е детерминиран процес, би било оптимално да има касета с N p / dc разделители, всеки от които може да бъде експресиран и да се свърже с точно dc комплекси, предсказвайки, че L = ( dc / N p ) − 1 . Въпреки това, тъй като генната експресия е по същество стохастична, понякога би имало повече от d c свързани комплекси за даден спейсер, а понякога и по-малко. Това стохастично разпръскване, възникващо отчасти поради ефектите на крайния размер, отслабва зависимостта на оптималния размер на касетата от прага dc , причинявайки експонентата β и коефициента C да бъдат леко <1 в оптималното мащабиране на размера на касетата L ∼ C ( dc / N p ) − β (фиг. 4, Вложки) виж Материали и методи за по-подробно извличане. Ако прагът на откриване е мек, ефективността на механизма CRISPR е по-малко зависима от наличието на поне dc комплекси, специфични за фага. В допълнение, наличието на малко по-голям брой комплекси от прага на откриване може да увеличи вероятността за откриване. Тези ефекти се комбинират, за да произведат мащабиране между оптималния размер на касетата и ефикасността на откриване, L ∼ ( d c / N p ) − 1 (фиг. 4 Б и ° С).

        В обобщение, нашият модел прогнозира, че по-ефективен механизъм CRISPR (т.е. с по-нисък праг на откриване d c или по-голям брой комплекси N p ) трябва да бъде свързан с по-голямо количество имунна памет.

        Нашият модел също така предоставя оценка за типичен брой спейсери на клетка в бактериални популации, противодействащи на разнообразен набор от патогени (режим на K ≫ N p ). Да приемем, че типичният брой Cas комплекси е N p ~ 1000, сравним с броя на копията на други протеини в бактериална клетка (40, 41) и че бързото откриване на инфектиращ фаг изисква скромен брой активирани CRISPR-Cas комплекси , с праг на откриване в диапазон от dc ∼ 10 до 100 (32). След това нашият модел прогнозира, че оптималният имунен репертоар трябва да бъде в диапазона от L ∼ 10 до 100, в съответствие с емпирични наблюдения (2, 7 ⇓ ⇓ ⇓ –11).

        Оптимална памет с множество специфични разделители.

        Касетите CRISPR могат да съдържат повече от един разделител, специфичен за даден вирус. Това може да се случи например поради праймиране, при което наличието на някои спейсери, които поне частично съвпадат с нахлуващ фаг, може да доведе до придобиване на допълнителни спейсери (23 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –30), повишавайки ефективността на CRISPR -Cas система срещу повтарящи се или високоразпространени вируси. От друга страна, наличието само на няколко спейсера от даден тип фаг изглежда до голяма степен достатъчно за неутрализиране на реинфекции (6, 8, 16 ⇓ ⇓ –19), дори от съвместно еволюиращи вируси. Освен това, експериментално е известно, че касетите от див тип CRISPR са насочени към различни фаги, а не най-вече да имат разделители, насочени към няколко заплахи.

        По този начин ние обобщаваме нашия модел, за да позволим 1 < s < s max спейсери да бъдат придобити от всеки тип фаг (подробности в Приложение на SI). След реф. 6, 8 и 16 ⇓ ⇓ –19 се очаква параметърът s max да бъде малък брой от порядъка на шепа. В този случай оптималният брой спейсери остава подобен на описания по-горе резултат, когато е имало най-много един спейсер за всеки фаг (Приложение на SI, Фиг. S3 и S4). За пълнота тествахме и ефектите от разрешаването на s max да бъде неограничен. В този случай, когато разнообразието на фаговите видове е високо, както се очаква (15), резултатите отново остават непроменени. Това е така, защото наличието на много спейсери от един фагов тип идва с цената на неоткриването на друг тип фаг, когато броят на комплексите е ограничен от N p . Ако фаговото разнообразие е достатъчно ниско, наличието на много спейсъри за всеки вирус не изключва нито един уникален тип фаг да бъде добре представен, следователно, размерът на имунния репертоар в този сценарий не е ограничен.


        Нов инструмент CRISPR включва и изключва гените като ключ за осветление

        Класическата версия на wunderkind за редактиране на гени буквално нарязва ген на парчета, само за да го изключи. Ефективно е, да. Но това е като да поставите електрически проводник през шредер за хартия, за да изключите неправилно работеща крушка. След като проводниците са отрязани, няма връщане назад.

        Защо вместо това да не добавите ключ за осветление?

        Този месец екип от Калифорнийския университет в Сан Франциско (UCSF) преосмисли CRISPR, за да направи точно това. Вместо директно да действа върху гените - безвъзвратно отстраняване или размяна на генетични букви - новият вариант на CRISPR е насочен към биологичната машина, която естествено включва или изключва гените.

        Превод? CRISPR вече може да „завърти превключвател на светлината“, за да контролира гените – без изобщо да ги докосва директно. Става по-добре. Новият инструмент, CRISPRoff, може да накара гена да остане мълчалив в продължение на стотици поколения, дори когато клетките му гостоприемници се трансформират от стволови клетки в по-зрели клетки, като неврони.След като гените на „спящата красавица“ са готови да се събудят, допълнителен инструмент, CRISPRon, включва отново превключвателя на светлината.

        Тази нова технология „променя играта, така че сега вие основно пишете промяна [в гени], която се предава“, каза авторът д-р Люк Гилбърт. „По някакъв начин можем да се научим да създаваме версия 2.0 на CRISPR-Cas9, която е по-безопасна и също толкова ефективна.“

        Шегуваш се. Как?

        Същността е нещо, наречено епигенетика. Това е цяла система от химикали и протеини, която контролира дали даден ген е включен или изключен.

        Ако това звучи объркващо, нека започнем с това как всъщност изглеждат гените в клетката и как се включват. Под „включване“ имам предвид, че гените се превръщат в протеини – нещата, които изграждат нашата физическа форма, контролират метаболизма ни и ни карат да се развиваме като живи, дишащи хора.

        Гените са вградени в ДНК вериги, които се увиват много плътно около основния протеин - нещо като увити аспержи с бекон. За да се включат гените, първата стъпка е, че те се нуждаят от куп протеини, за да изтръгнат нежно ДНК веригата от „аспержите“, така че гените вече свободно плават в тяхната клетъчна космическа капсула, наречена ядро.

        След като тази част от беконовата ДНК е свободна, повече протеини се втурват към гена. След това те ще търкалят нуклеотидите на гена (A, T, C и G) като косачка за трева. Вместо мулчиране обаче, тази биологична „машина“ изхвърля пратеник, който казва на клетката да започне да произвежда протеини – иРНК. (Да, същите неща, които правят някои от нашите ваксини срещу Covid-19.) mRNA насочва протеиновата фабрика на клетките ни да започне производството и воаля, този ген вече е включен!

        Всичко, което нарушава този процес, потиска способността на гена да се превръща в протеини, като по същество го изключва. Той е изключително мощен - защото една единствена епигенетична машина може да контролира стотици или хиляди гени. Това е главен превключвател на светлината за генома.

        Писателят на генетичната памет

        Екипът започна със система CRISPR, която има кастриран Cas9. Това означава, че протеинът, който обикновено участва в разрязването на ген, Cas9, вече не може да отрязва ДНК, дори когато е привързан към правилното място от другия компонент, водещата РНК „кървавица“. След това те захванаха протеин, който участва в изключването на гените към тази версия на CRISPR.

        Ето умната част: протеинът е предназначен да отвлече естествен епигенетичен процес за изключване на гените. Гените често се изключват чрез естествен процес, наречен „метилиране“. Обикновено процесът е преходен и обратим при ген. CRISPRoff управлява този процес, като на свой ред изключва всеки целеви ген, но за много по-дълъг период от време - без физически да разкъсва гена.

        Благодарение на „усилващата“ сила на епигенетиката, CRISPRoff позволява на изследователите да станат големи. В един експеримент, насочен към над 20 000 гена вътре в обезсмъртени човешки бъбречни клетки с CRISPRoff, екипът успя надеждно да изключи тези гени.

        Недоволен от еднопосочната улица, екипът след това проектира подобен вариант на CRISPR, с различен протеин, свързан с епигенетика, наречен CRISPRon. В клетките в петриевите блюда CRISPRon успя да отмени CRISPRoff и от своя страна да включи гените отново.

        „Вече имаме прост инструмент, който може да заглуши огромното мнозинство от гените“, каза авторът на изследването д-р Джонатан Вайсман. “Можем да направим това за множество гени едновременно без увреждане на ДНК… и по начин, който може да бъде обърнат.“

        Отидете на Разстоянието

        Още по-лудото е, че изключването е продължило през поколенията. Когато екипът изключи ген, свързан с имунната система, той се запази в продължение на 15 месеца - след около 450 клетъчни поколения.

        Редакциите продължиха и чрез фундаментална трансформация, тоест пътуването на клетката от индуцирана плурипотентна стволова клетка (iPSC) до неврон. iPSC често започват като кожни клетки и се подмладяват в стволови клетки чрез химическа баня, когато след това предприемат второ пътуване, за да станат неврони. Този процес често заличава епигенетичните промени. Но за изненада на авторите, влиянието на CRISPRoff остана чрез трансформациите. В един експеримент екипът установи, че изключването на ген, свързан с болестта на Алцхаймер в iPSCs, също намалява количеството впоследствие кодирани токсични протеини в получените неврони.

        „Това, което показахме, е, че това е жизнеспособна стратегия за заглушаване на Tau и предотвратяване на експресията на този протеин“, каза Вайсман, подчертавайки само един начин, по който CRISPRoff – и контролирането на епигенома като цяло – може да промени медицината.

        CRISPR 2.0

        Това не е първият път, когато някой се опитва да насочи епигенома с CRISPR. Същият екип преди това експериментира с друг набор от варианти на CRISPR, които опитаха същото. Разликата между двете е времето и стабилността. С предишната настройка учените се бореха да запазят „превключвателя на светлината“ изключен за едно поколение. Новият няма проблеми да поддържа промени чрез множество деления – и трансформации – в генома.

        Надежден инструмент CRISPR за епигенетика е безумно мощен. Въпреки че имаме лекарства, които действат по подобен начин, те са далеч по-малко точни и идват с доза странични ефекти. Засега обаче CRISPRoff и CRISPRon работят само в клетки в петриеви блюда и следващата стъпка към геномно надмощие би била да се гарантира, че работят в живи същества.

        Ако случаят е такъв, това може да промени генетичното редактиране завинаги. От препрограмиране на биологични вериги в синтетичната биология до отвличане или обръщане на такива за предотвратяване на болести, епигенетичното препрограмиране предлага начин да се направи всичко, без изобщо да се докосва ген, премахвайки заплахата от мутации - като същевременно води до трайни ефекти през поколенията.

        „Мисля, че нашият инструмент наистина ни позволява да започнем да изучаваме механизма на наследствеността, особено епигенетичната наследственост, което е огромен въпрос в биомедицинските науки“, каза авторът на изследването д-р Джеймс Нунес.


        Променливост в трайността на имунитета на CRISPR-Cas

        Устойчивостта на резистентността на гостоприемника е предизвикана от способността на патогените да избягат от защитата на своите гостоприемници. Разбирането на променливостта в трайността на резистентността на гостоприемника е от първостепенно значение за проектиране на по-ефективни стратегии за контрол срещу инфекциозни заболявания. Тук изучаваме издръжливостта на различни групирани, редовно разположени къси палиндромни повторения-Cas (CRISPR-Cas) алели на бактериите Streptococcus thermophilus срещу литични фаги. Открихме значителна вариабилност в издръжливостта между различните резистентни бактерии. Тъй като бягството на фага се задвижва от мутация в фаговата последователност, насочена от CRISPR-Cas, ние проучихме разходите за фитнес, свързани с тези мутации на бягство. Открихме, че средно escape мутациите намаляват годността на фага. И все пак, големината на тази фитнес цена не предсказва трайността на имунитета на CRISPR-Cas. Ние твърдим, че тази променливост в трайността на резистентността може да се дължи на вариации в скоростта на фаговите мутации или в дела на смъртоносните мутации в генома на фага. Тези резултати имат важни последици за коеволюционната динамика между бактериите и фагите и за оптималното разгръщане на стратегии за резистентност срещу патогени и вредители. Разбирането на трайността на имунитета на CRISPR-Cas може също да помогне за разработването на по-ефективни стратегии за генно задвижване, базирани на технологията CRISPR-Cas9.

        Тази статия е част от тема на дискусионна среща „Екологията и еволюцията на прокариотната адаптивна имунна система CRISPR-Cas“.

        1. Въведение

        Общественото здравеопазване и селското стопанство са постоянно предизвикани от разпространението на инфекциозни заболявания. Разработен е арсенал от различни профилактични и терапевтични стратегии за ограничаване на циркулацията на патогени (например интрогресия на резистентни гени в растителните сортове, използване на антимикробни лекарства). И все пак, ефикасността на тези интервенции може бързо да бъде ерозирана от еволюцията на популациите от патогени [1–4]. Важно е да се отбележи, че отделните защитни стратегии могат да доведат до много различни еволюционни резултати. Например, известно е, че несъвършеният имунитет избира за по-голяма агресивност и вирулентност при патогени [5,6]. Освен това отделните защитни стратегии могат да се различават по своето ниво на издръжливост. Защо някои стратегии за защита на домакина се преодоляват много бързо, докато други остават ефективни за дълъг период от време [4,7,8]? По-доброто разбиране на издръжливостта на защитните сили на гостоприемника (дефинирана като обратна на скоростта на адаптация на патогена към тези защити) е от ключово значение за разработването на устойчиви стратегии за управление на патогени и вредители [7,9].

        Емпирични и експериментални изследвания върху растителни патосистеми изиграха ключова роля при идентифицирането на основните фактори, действащи върху трайността на резистентността на гостоприемника [4,7,9–11]. Например, известно е, че вида на устойчивостта на растенията оказва значително влияние върху скоростта на адаптация на патогена. Качествено съпротивата, реакция "всичко или нищо", често се счита за по-малко издръжлива от количествен устойчивост, което намалява прогресията на болестта в растението. Този ефект обикновено се приписва на по-простия генетичен детерминизъм на адаптацията на патогена към качествена резистентност, която включва няколко (или дори единични) основни гени за вирулентност [12]. Обратно, адаптирането към полигенния детерминизъм на количествената резистентност изисква множество мутации на патогени [13,14]. И все пак, качествената устойчивост показва много вариации в издръжливостта [4]. Класическото обяснение за тази вариация в издръжливостта включва селективни ограничения, действащи върху популацията на патогена. По-конкретно, защитата на гостоприемника вероятно ще бъде по-трайна, ако мутациите (алели на вирулентност), които позволяват на патогена да избяга от качествената резистентност, са свързани с разходи за фитнес [4,12]. Разбирането на селективните ограничения, действащи върху местата, насочени от различни механизми на резистентност, може да помогне за прогнозиране на трайността на резистентността и да ограничи скоростта на адаптация на патогена [4,15]. Тестването на тази хипотеза обаче често е трудно при растителни патосистеми, където измерването на трайността на специфичните механизми на резистентност в контролирани експерименти поражда практически трудности [16,17].

        Тук ние използваме взаимодействието между бактериите и техните литични бактериофаги (или фаги), за да изследваме факторите, които модулират трайността на резистентността на гостоприемника. Бактериите имат достъп до широк спектър от защитни системи, за да се защитят срещу фаги [18–21]. Сред тези отделни защитни системи, групирани редовно взаимно разположени къси палиндромни повторения - свързани с CRISPR гени CRISPR-Cas има уникалната способност да генерира стотици различни алели на резистентност, насочени към различни места в генома на фага [22]. Тук ние използваме това уникално свойство, за да изследваме променливостта в издръжливостта между отделни алели за резистентност на CRISPR-Cas, насочени към един и същ фаг. CRISPR-Cas е адаптивна прокариотна имунна защита, която интегрира в CRISPR локуса (интегриране на спейсер) малка фагова ДНК последователност (протоспейсърът, тук дълъг 30 bp) от нахлуващ геном и използва тази памет за насочване и разграждане на последващо нахлуване съвпадаща ДНК (интерференция) [23]. За да изберат и интегрират специфичен протоспейсър от чужда нуклеинова киселина в неговия CRISPR масив, много системи CRISPR-Cas разчитат на последователност от 2–5 bp, прилежащия към протоспейсър мотив (PAM) [24], обграждаща едната страна на последователността на протоспейсъра и задължително за интегриране и интерференция на дистанционер. Предвид неговия размер, PAM присъства много пъти в генома на фага, което потенциално води до стотици различни резистентности, насочени към различни протоспейсъри [22].

        За да проучим променливостта на устойчивостта на CRISPR, ние наблюдавахме еволюцията на вирулентен фаг 2972 ​​срещу CRISPR1 масива от Streptococcus thermophilus DGCC7710. Streptococcus thermophilus е грам-положителна бактерия, широко използвана в млечната индустрия за приготвяне на кисело мляко и сирене. Имунитетът на тази бактерия срещу фагите разчита главно на две активни CRISPR-Cas системи от тип II-A, като CRISPR1 е по-активният [24]. Когато се придобие спейсер, насочен към фаг 2972, имунитетът на CRISPR блокира литичния цикъл на целевия фаг [23,25] и по този начин може да се разглежда като много специфична форма на качествен съпротивление. В тази система фагите могат да избягат само от CRISPR-Cas чрез мутиране на тяхната PAM или семенна последователност (т.е. проксималната част на протоспейсъра) [26]. По-долу първо определихме количествено способността на фаг 2972 ​​да избягва набор от резистентни бактерии, като всяка от тях има в своя CRISPR1 масив отделен нов спейсер, насочен към уникално единично място на протоспейсър в генома на фага. Второ, ние изолирахме избягали фагови мутанти върху всяка от резистентните бактерии (например всеки избягал фаг е мутирал в специфичен и различен протоспейсър регион) и ние характеризирахме тяхната относителна годност по време на инфекцията на популация от чувствителни към фаги бактерии. Този експериментален протокол ни позволи да обсъдим потенциалната връзка между фитнес ефектите на escape мутации във фага и издръжливостта на различни алели на резистентност в бактериите.

        2. Материал и методи

        (а) Бактериални щамове и фаги

        Бактерията S. thermophilus DGCC 7710 (WT) и неговият вирулентен фаг 2972 ​​са получени от Референтния център за бактериални вируси Félix d’Hérelle (www.phage.ulaval.ca) [27]. Бактериите се отглеждат в LM17 бульон (M17 Oxoid (37 g l -1 ) с 5 g l -1 лактоза) и се инкубират при 40 ° C. За амплификация на фага 10 mM стерилен CaCl2 се добавят към бульона. Използвайки стандартизиран протокол, описан в [28], култура на S. thermophilus DGCC 7710 беше предизвикан с вирулентен фаг 2972, а оцелелите колонии/клетки (мутанти, нечувствителни към бактериофаги (BIM)) бяха скринирани чрез полимеразна верижна реакция (PCR) за разширяване на техния CRISPR масив, последвано от 2% агарозна електрофореза. Праймерните последователности и PCR протоколът могат да бъдат намерени в електронния допълнителен материал, S1. За да потвърдим, че всеки BIM притежава различен спейсер, ние секвенирахме новопридобитите дистанционери (секвениране на Sanger от Eurofins Genomics MWG). Общо 17 различни BIM, всеки с един и отделен дистанционер, придобит в активния CRISPR1 локус (проверихме дали не е придобит друг дистанционер в другия активен CRISPR масив), бяха запазени и използвани в това проучване. Дистанционните последователности са предоставени в електронния допълнителен материал, S2. И накрая, протоспейсърите бяха позиционирани върху генома на фаг 2972, който е публикуван в [27].

        (b) Откриване на фаги и титруване

        Бактериалните тревни площи се получават чрез посяване на 6 ml мек агар (LM17 + CaCl2 с 0,8% агар и 400 μl бактерии в средна експоненциална фаза) върху плочи, предварително изляти с 30 ml твърд агар (LM17 + CaCl2 с 1,5% агар). За фагово титруване се добавят 50 μl разредени фаги към мек агар. За откриване на фаги, 5 μl фагов разтвор бяха забелязани директно върху втвърдения мек агар. Когато е необходимо, фагите се разреждат във фагов буфер (50 mM Tris-HCl pH 7,5 + 100 mM NaCl + 8 mM MgSO4). Плаките се инкубират една нощ при 40°С и плаките се преброяват (титруване) или записват (откриване).

        (c) Издръжливост на устойчивост

        Трайността на резистентността на гостоприемника се определя като времето, през което тя остава ефективна [7]. При отсъствието на вече съществуващ избягал паразит, трайността на резистентността зависи от два фактора: (i) скоростта, с която се генерират избягали мутанти, и (ii) тяхното разпространение в популацията на гостоприемника. В случай на хомогенна устойчива популация гостоприемник, всеки избягал мутант ще се разпространи бързо в популацията. В този прост случай трайността на резистентността зависи главно от скоростта, с която жизнеспособните мутанти се появяват чрез мутация.

        Използвахме триетапен протокол Luria-Delbrück за измерване на скоростта на мутация на фаг за всяка целева последователност чрез 17 различни BIM (вижте електронния допълнителен материал, S3 за графичен преглед на протокола). Тези измервания бяха репликирани три пъти с три независими клонални лизати на фаг 2972. За да се оцени потенциалното влияние на стоящата генетична вариация върху скоростта на бягство, ние измервахме първоначалната честота на escape мутанти срещу всеки BIM. Установено е, че честотата на съществуващи мутанти към всеки от 17-те различни BIM е под 2,9 × 10 -5 . Тъй като ние инокулирахме малко количество фаг 2972 ​​(виж по-долу), се приема, че влиянието на стоящата генетична вариация върху адаптацията на фага е незначително.

        В първата стъпка от този протокол, за всеки BIM, фагите от див тип (WT) бяха амплифицирани в 96 независими повторения върху WT-фаг-чувствителните бактерии (т.е. при липса на селекция). Във всяко повторение, 20 μl LM17 + CaCl2 бяха инокулирани с 0, 2 μl WT бактерии в средна експоненциална фаза, фаги при концентрация от 300 плакообразуващи единици (PFU) / 20 μl и инкубирани при 40 ° С в продължение на 24 часа. Това потвърдихме чрез титруване на четири повторения преди инкубацията ни ≈ 300 PFU/20 μl и измерихме не чрез титруване на 10 произволно избрани лизата. Ние открихме не ≈ 1,72 × 10 6 PFU/20 μl.

        Във втората стъпка на протокола, бактериите от всяко копие се пелетират с 5-минутно центрофугиране (6189 g) (виж електронния допълнителен материал, S4) и 25% (5 μl) от супернатантата се инокулират в 200 μl култура на фокалния BIM и се инкубира в продължение на 24 часа при 40 ° С. Тази втора стъпка гарантира, че дори при повторения, където честотата на избягалите мутанти е малка в края на първата стъпка, честотата на избягалите мутанти ще бъде достатъчно висока, за да бъде открита в третата стъпка от протокола.

        В последната и трета стъпка на протокола, наличието на избягали фаги във всяка отделна реплика се оценява с помощта на анализи за откриване на фаги. ПЕ, вероятността за бягство, беше изчислена като частта от повторенията, при които се откриваше избягането на фага. Възможно е [29] да се оцени скоростта на escape мутации спрямо всеки BIM, като се използва:

        (d) Относителна годност на избягалите от фаг мутанти

        За всеки от 17-те различни BIM, ние избрахме на случаен принцип пет фагови изолата, които избягаха от бактериална резистентност. Единична плака от всеки от тези пет изолата беше амплифицирана в течност и повторно изолирана два пъти върху плочи, върху BIM, от която бяха изолирани. След амплификация, фагите и останалите бактерии се разделят чрез филтриране (0.2 μm) и фагите се съхраняват в 20% глицерол при -80 ° С. Геномното секвениране (виж електронния допълнителен материал, S5 за списъка с праймери и S6 за тяхната протоспейсърна последователност) потвърждава, че всички избягали фаги съдържат мутации в тяхната PAM или тяхната семенна последователност. Този протокол генерира колекция от escape мутанти за всички BIM.

        Относителната годност на всички избягали мутанти се определя с помощта на трикратни конкурентни експерименти срещу референтен фаг, който съдържа делеция от 37 bp в своя orf24 (виж електронния допълнителен материал, S7).Това изтриване ни позволи лесно да различим референтния щам от всички други избягали мутанти (виж електронния допълнителен материал, S7). Приблизително 3000 фага (50% избягал мутант и 50% референтен фаг) бяха инокулирани в 10 ml LM17 + CaCl2 допълнен със 100 μl WT бактерии в ранна стационарна фаза. След 24-часова инкубация при 40 ° С, останалите бактерии се отстраняват чрез филтриране и фагите се съхраняват при -80 ° С. Преди и след амплификацията, пропорцията на тествания фаг се измерва чрез количествена PCR (qPCR) (виж електронния допълнителен материал, S7). Относителната годност на избягалия мутант м беше определено с помощта на

        Д) Статистически анализи

        Всички статистически анализи бяха проведени с помощта на софтуер R (v. 3.3.2, [30]), чрез RS tudio (v. 1.0.136).

        Извършихме анализ на дисперсията (ANOVA), за да определим дали позицията на протоспейсъра върху фаговия геном влияе върху издръжливостта на резистентността.

        Линейни модели бяха използвани за анализ на относителните данни за фитнес. В първия модел тествахме ефекта на генотипа на фага върху относителната годност. За да се контролира степента на фалшиво откриване, тъй като всички избягали мутации се сравняват с референтния фаг независимо, процедурата на Бенджамини-Хохберг беше приложена към получените стр-стойности. Във втория модел тествахме въздействието на типа мутация (синоним срещу несиноним) върху относителната годност на фагите, избягващи BIM, насочени към orf (36 фагови избягали мутанти). В третия модел ние оценихме ефекта от относителната годност на избягалите от фаг мутанти върху трайността на резистентността на техния съответен BIM.

        3. Резултати

        За да проучим издръжливостта на различни алели CRISPR, ние генерирахме 17 различни устойчиви щамове (BIM), характеризиращи се с нов и уникален разделител в масива CRISPR1. Всеки спейсер е насочен към различен протоспейсър, т.е. различна част от фаговия геном (електронен допълнителен материал, S2). Общо 13 от 44-те фагови гена (както и някои некодиращи региони) бяха насочени от поне един спейсер, което доведе до добро покритие на фаговия геном от тези 17 BIM (фигура 1).

        Фигура 1. Променливост в трайността на CRISPR-Cas имунитета. Степента на мутация на 17 протоспейсъра, чиито позиции са обозначени на х-ос, бяха измерени с помощта на флуктуационни тестове. ПЕ стойностите, т.е. броят на репликите, в които еволюира мутантът, избягал от фага, се съобщават и показват хетерогенност между целевите последователности, което предполага, че има хетерогенност в трайността на резистентността на CRISPR-Cas.

        Нашите мерки за издръжливост на BIM, използвайки тестове за флуктуация, разкриха значителни вариации в способността на фага да избягва различни BIMs (фигура 1 електронен допълнителен материал, S8, ANOVA, Ф16 = 10.89, стр = < 0,001). Използвахме също вероятността за бягство, за да оценим скоростта на мутации за всяка целева последователност (семена и PAM последователности) (виж електронния допълнителен материал, S9). Средната скорост на мутация е оценена на 3,4 × 10 -7 мутация/целева последователност/репликация и скоростта на бягство при по-малко издръжливия BIM е 123 пъти по-висока от един от най-издръжливите BIM.

        Едно възможно обяснение за наблюдаваната вариация в издръжливостта на резистентността може да е резултат от разликите в разходите за фитнес, свързани с техните съответни избягали мутанти. По принцип използването на съотношението на реплики без избягали мутанти в протокола Luria-Delbrück дава оценка на степента на мутации, която не се влияе от селекцията на жизнеспособни мутанти [31]. За да проучим валидността на тази хипотеза, ние изолирахме 40 фагови мутанта, избягващи 17-те отделни единични CRISPR-резистентности. Общо 35 избягали фага носят единична bp мутация в целевата последователност, четири от останалите фаги носят двойни bp мутации в целевата последователност, един избягащ фаг има единична bp делеция (виж електронния допълнителен материал, S6). Сред заместванията 27 са трансверсии, 12 са пуринови преходи и четири пиримидинови прехода. Десет избягали мутанти се характеризират със синонимни мутации (вижте електронния допълнителен материал, S10).

        За да измерим годността, ние се състезавахме с всеки от избягалите фагови мутанти срещу референтен фаг и измервахме тяхното относително изобилие преди и след експеримента. От тези данни изведохме относителна годност. Открихме, че относителната годност е силно променлива, варираща от -6,21 до 0,68 със средно -2,22 и стандартно отклонение от 1,71 (фигура 2 виж електронния допълнителен материал, S11). Въпреки че по-голямата част от избягалите мутанти на фага имаха по-ниска годност от WT фага (32 от 40), някои избягали мутанти бяха неутрални (8 от 40) (фигура 2, електронен допълнителен материал, S11). Наличието на несинонимни мутации не е добър предиктор за годността на бягството на мутант (T = −0.509, П(Р > T) = 0,612) и всички тествани синонимни мутации, но една по-ниска фагова годност (виж електронния допълнителен материал, S12). Открихме, че пригодността за бягство на мутантите не е добър предсказател за издръжливостта на всеки BIM (фигура 3, T = −0.423, П(Р > T) = 0,673). Следователно, хетерогенността в издръжливостта на резистентността на CRISPR не е причинена от хетерогенността на разходите за фитнес, свързани с тези мутации на бягство (фигура 3).

        Фигура 2. Разпределение на фитнес ефектите на escape мутации във фага. Относителната годност беше измерена чрез състезателни експерименти с колекция от 40 избягали фага, мутирали върху техните семена или PAM последователности. Фагите, които носят неутрални и вредни мутации, са представени съответно в средно и тъмно сиво. Черните точки показват относителната годност на всеки избягал фаг. Пунктираният сегмент представлява годността на WT фаг 2972. Стойността на годността на всеки избягащ фаг също е предоставена в електронния допълнителен материал, S11.

        Фигура 3. Относителна годност на избягалите фаги мутанти спрямо издръжливостта (вероятност за бягство ПЕ) на съответните им BIM. Всеки цвят съответства на един BIM и всяка точка на един избягащ фаг. Лентите за грешки съответстват на 95% доверителни интервали. Необработените данни са предоставени в електронния допълнителен материал, S9 и S11.

        4. Обсъждане

        Изследвахме вариацията в способността на вирулентен фаг 2972 ​​да избягва различни алели на резистентност в имунната система CRISPR-Cas на своя гостоприемник S. thermophilus DGCC7710. Открихме (i) значителни вариации в издръжливостта между тези различни резистентни щамове (и следователно в очевидната степен на мутация на фаговите протоспейсъри) и (ii) значителни вариации в годността сред фагите, носещи избягали мутации. И все пак цената на тези избягали мутации не е свързана с издръжливостта на съответните им резистентни щамове. Ако разходите за годност на escape мутациите не са добър предсказател за издръжливостта на резистентността, какво движи вариацията в издръжливостта? Ние вярваме, че два взаимно изключващи се процеса биха могли да обяснят наблюдаваните модели: (i) вариация в скоростта на мутациите по протежение на фаговия геном и (ii) вариация във вероятността за генериране на смъртоносни мутации между различни последователности, насочени от системата CRISPR-Cas .

        Първо, вариация в скоростта на мутациите по протежение на фаговия геном може да е резултат от хетерогенност на репликационната машина. Подобна вариация в скоростта на мутациите е описана по-рано при дрожди [32], РНК вируси [33] и бактерии [34], но доколкото ни е известно, все още не и в бактериофагите. Точният механизъм, използван от фаг 2972 ​​за репликиране и възстановяване на неговия геном, е неизвестен, което ограничава способността ни да тестваме тази хипотеза. Въпреки това, тъй като фаг 2972 ​​кодира и експресира своя собствена репликационна машина и не притежава никакъв механизъм за възстановяване [27,35], изкушаващо е да се предположи, че не са включени механизми за възстановяване и че цялата репликация се извършва от неговата машина за репликация. Тази машина може да доведе до значителни вариации между различните части на фаговия геном. Имайте предвид обаче, че повечето избягали мутанти, които изолирахме, се дължат на трансверсии вместо на преходи (вижте електронния допълнителен материал, S10), докато повечето машини за репликация показват предубеден модел към преход [32,36]. Ако в основата на наблюдаваната хетерогенност в издръжливостта на резистентността е била хетерогенна степен на вярност, 2972 ​​машини биха имали неконвенционално мутационно отклонение.

        Второ, вариациите в честотата на смъртоносните мутации по протежение на фаговия геном също могат да допринесат за наблюдаваните вариации в издръжливостта на BIM. Смъртоносните мутации са много чести и могат да достигнат до 40% от общите мутации на вирусите [37–39], но доколкото ни е известно, хетерогенността на вероятността от смъртоносна мутация по протежение на генома не е проучена. Тъй като е известно, че някои гени са съществени, докато други са допълнителни (напр. orf39 и orf41 не се експресират по време на инфекция от фаг 2972 ​​[35]), можем да очакваме, че мутациите в различни гени трябва да доведат до различни фракции от смъртоносни мутации и следователно до вариации в издръжливостта между BIM, насочени към тези различни гени.

        Необходими са допълнителни експерименти, за да се оцени относителната важност на вариациите в (i) скоростта на мутациите и (ii) дела на леталните по протежение на фаговия геном върху трайността на резистентността към CRISPR. Хетерогенността в скоростта на мутация може да бъде оценена чрез измерване на издръжливостта на няколко спейсера, които са насочени към различни нефункционални кодиращи региони на фаговия геном. Фаг 2972 ​​носи такава последователност под формата на непълен лизогенен модул, който не е експресиран [27,35]. Ако можехме да създадем различни BIM, насочени към този модул, всяка хетерогенност в издръжливостта между тези BIM би била резултат само от хетерогенност в скоростта на мутации между различните целеви последователности. За да се оцени алтернативната хипотеза, че вариацията в издръжливостта е резултат от вариация във фракцията на смъртоносните мутанти, може да се измери директно тази фракция от смъртоносни мутанти чрез систематично въвеждане на точкови мутации в целевата последователност на BIM с контрастиращи нива на издръжливост [37– 39]. Благодарение на скорошния напредък в молекулярната биология, редица мутанти могат да бъдат произведени чрез систематична промяна на всеки от нуклеотидите на целевата последователност [40,41]. Сравнението на броя на смъртоносните мутации за трайна и нетрайна резистентност би позволило да се оцени директно въздействието на този фактор върху вариацията на трайността.

        Известно е, че имунитетът на CRISPR-Cas генерира и поддържа голямо разнообразие от алели на резистентност срещу един и същ фаг [22,42] и е известно, че това разнообразие в резистентността ограничава растежа на фаговата популация [29,42]. Теоретичните модели и експерименталните тестове показват, че такова разнообразие ограничава еволюционната поява на патогените [29]. И все пак, тези проучвания игнорират хетерогенността в трайността на резистентността между различните алели. Нашите резултати показват, че друга потенциална полза от генерирането на това разнообразие е да се проучи диапазон от устойчивост на устойчивост. Най-трайните алели ще изпреварят другите BIM и това може да осигури много стабилен начин за възпрепятстване на еволюцията на фага. В допълнение към това разнообразие между гостоприемниците, една клетка може да придобие повече от един разделител срещу един и същ паразит. Придобиването на множество спейсери, насочени към различни части на фаговия геном, предполага, че фагът се нуждае от множество мутации, преди да може да зарази тази мултирезистентна бактерия [25]. Тъй като повечето escape мутации са скъпи (фигура 2), носенето на множество escape мутации вероятно ще намали драстично годността на фага. Обратно, придобиването на множество разделители не променя годността на бактериите [43]. Тази асиметрия може да помогне за обяснението на крайното изчезване на фагови популации, които еволюират заедно с CRISPR-Cas имунитет [22,44]. Също така е важно да се отбележи, че някои фаги са развили способността да побеждават CRISPR имунитета, използвайки анти-CRISPR протеини, които инхибират защитата, предоставена от CRISPR-Cas [45,46] (обърнете внимание, че доколкото ни е известно, фаг 2972 ​​не носи анти -CRISPR срещу S. thermophilus системи CRISPR). Въпреки че анти-CRISPR може да бъде частично ефективен срещу CRISPR-Cas, сътрудничеството между фагите гарантира, че над минимална концентрация, фагите могат да нахлуят в резистентна популация на гостоприемник, без да придобият escape мутации в последователностите, насочени от CRISPR-Cas [47,48] .

        Streptococcus thermophilus е широко използван от млечната индустрия за производството на няколко ферментирали млечни продукта (кисело мляко, сирене) и идентифицирането на BIM с особено трайна устойчивост може да има много практични последици. Използването и/или комбинацията от тези BIM вероятно ще защити стартерните култури срещу фагова инфекция. В допълнение, би било особено полезно да се идентифицират трайни спейсери, които са насочени към свързани фаги. Такива универсални дистанционери са наблюдавани преди [23]. Използването на издръжлив универсален дистанционер би могъл значително да подобри устойчивостта на S. thermophilus щамове. Нашият биологичен модел също така предоставя уникална възможност за експериментална оценка на ефективността на различни стратегии за интервенция върху дългосрочната ефикасност на резистентността към патогени. По този начин може да предостави важна информация за прилагането на устойчиво управление на патогени и вредители [4,9,29].

        В допълнение към тези приложения в млечната индустрия и в селското стопанство, технологията CRISPR-Cas9 може да се използва като задвижваща ендонуклеаза, т.е. генетичен инструмент, който прави конструиран алел разпространен в естествените популации чрез немендална наследственост [49]. Всъщност, в хетерозигота, носеща CRISPR-Cas9 и неговия водач, ендонуклеазата ще се насочи и ще разцепи хомоложния алел. Тъй като механизмите за възстановяване обикновено включват хомоложни ДНК последователности, те обикновено добавят копие на CRISPR-Cas9 и неговия водач на мястото на предишния алел, което води до бързо разпространение на CRISPR-Cas9/водач в популацията [49,50 ]. Въпреки това, ако присъствието на CRISPR-Cas9 е скъпо за неговия гостоприемник, е вероятно да се появи escape мутация и да наруши разпространението на генния двигател [50,51]. Нашите резултати показват, че трайността на стратегиите за генно задвижване, насочени към различни региони на генома, вероятно ще бъде много променлива. Разбирането на крайния източник на вариацията на издръжливостта е особено важно за ефективността на генния двигател, базиран на CRISPR-Cas9.


        Дизайнерски протеини Cas9

        Cas9-sgRNA „извън колчето“ катализира реакции на интерференция на R-контура, задействайки DDSB на мястото на R-контура. Това също улесни разработването на технологии за редактиране на гени, базирани на модифициране на протеиновата архитектура на див тип Cas9, нуклеазно инактивиран Cas9 (dCas9) и едноверижна режеща „никаза“ Cas9 (nCas9), включително регулиране на транскрипцията и изображения, прегледани наскоро в [61 ]. Сливания на протеин Cas9 също са генерирани за подобряване на HR в човешките клетки, като се променя изборът на пътя за възстановяване на ДНК на мястото на DDSB. Два примера са сливали CtIP и RAD52 с Cas9 [82,83].

        Слетият протеин CtIP беше изследван с помощта на два различни метода. Активно сливане на Cas9-CtIP беше в състояние да стимулира увеличаване на редактирането в сравнение със стандартния HR, а второто сливане на Cas9 усили допълнително HR чрез сливане на N-терминален фрагмент на CtIP, считан за домейн за усилване на HR (HE), т.е. от решаващо значение за започването на HR [82]. Слетият протеин RAD52 е проектиран със същата обосновка за форсиране на протеин, който е от решаващо значение за завършването на HR близо до мястото на Cas9 DDSB и е установено, че повишава ефективността на вмъкването на репортерна касета [83].

        Сливания на dCas9 или nCas9 с модифициращи ДНК ензими са улеснили редактирането на единични бази. Сливането на цитидин дезаминаза (CDA)-dCas9 генерира преход от C към T при насочени към R-контура цитозинови остатъци чрез генериране на урацил, който се заменя с тимин по време на последващо възстановяване на ДНК (Фигура 3) [84]. Прозорецът, генериран от ssDNA от R-примка, позволява на деаминазата да преобразува C в U. Чрез сливане на инхибитора на урацил гликозилаза (UGI) към C-края на CDA — възстановяването на базата с ексцизия на dCas9 беше предотвратено, което позволява възстановяването на несъответствие (MMR) да завърши Смяна на Т [84]. Системата е подобрена чрез сливане на втори UGI, за да благоприятства допълнително MMR, и Gam протеина, получен от бактериофаг, който свързва свободните краища на DDSBs, минимизирайки генерирането на In/Del. Аденин деаминаза, слята с dCas9, е ефективна при целенасочено превръщане на аденин в инозин, който от своя страна се превръща в гуанин [85]. Подобна система, РНК редактиране за програмируема замяна от А до I (REPAIR), също е докладвана за еднобазово редактиране на аденозин до гуанин чрез инозин междинен продукт в РНК транскрипти в клетки на бозайници, използвайки каталитично неактивен Cas13, клас 2 CRISPR- Ензим за редактиране на Cas РНК [86]. И накрая, разчитането на HR-базирано редактиране на генома CRISPR-Cas9 върху HR ензими на клетката гостоприемник може да направи привлекателно разработването на сливане на Cas9 с протеини, които са активни като сайт-специфични рекомбинази или имат подобна активност на интеграция на ДНК (Фигура 3). Cas9-медиираното образуване на R-примка в този сценарий би насочено към ДНК за интегриране на полезен товар на дуплексна ДНК, пренасян от слетия ензим.