Информация

Защо PEG е важен за ефективната трансформация на дрожди?

Защо PEG е важен за ефективната трансформация на дрожди?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Един от начините за трансформация на дрожди е чрез използване на литиев ацетат, едноверижна ДНК носител и PEG (1). Чудех се защо полиетиленгликолът е важен за ефективната трансформация. Как влияе върху поемането на чуждата ДНК? Yamakawa et al (2) показаха, че PEG е от съществено значение за възстановяването на клетките, но нямах достъп до този документ, за да прочета повече за него.

1. R Daniel Gietz & Robert H Schiest (2007). Високоефективна трансформация на дрожди с помощта на LiAc/SS носител ДНК/PEG метод

2. Ямакава, М., Хишинума, Ф. и Гунге, Н. (1985). Интактна клетъчна трансформация на Saccharomyces cerevisiae чрез полиетилен гликол. Agric. Biol. Chem. 43, 869-871.


http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/26634.html

Намерих този линк - пише 'ние всъщност не знаем'. Пише, че PEG свързва ДНК, предполагам, че предпазва мембраната от отрицателния й заряд и позволява интернализацията да се случи.

Предполагам, че амфипатичната природа на PEG, тъй като е частично хидрофобна, също помага за омекотяване на мембраната. Интересното е, че ако увеличите концентрацията на PEG отвъд границите, това намалява ефективността на процедурата.


Предполагам, че има аналогична функция в буферите за лигиране. Там той очевидно заема голяма част от обема и по този начин увеличава шанса за взаимодействие между битове ДНК.

В трансформационен буфер би трябвало да увеличи шанса ДНК да попадне в клетката. За съжаление единствената справка, която намерих за това, беше в Bitesizebio: http://bitesizebio.com/20/5-dna-ligation-tips/


Използване на ДНК на сперматозоидите от сьомга при трансформация на дрожди? - (26 юни 2006 г.)

Ще направя трансформация на вектор в pichia pasoris, но в протокола пише, че трябва да се използва ДНК от сперматозоиди от сьомга, засега знам само, че се използва като блокиращ агент, но използва ли се и като блокиращ агент в случай на трансформация? някой знае ли за какво е? и как работи??

ssDNA се използва и за свойствата на носителя при утаяване на вашата смес за лигиране.

Ще направя трансформация на вектор в pichia pasoris, но в протокола пише, че трябва да се използва ДНК от сперматозоиди от сьомга, засега знам само, че се използва като блокиращ агент, но използва ли се и като блокиращ агент в случай на трансформация? някой знае ли за какво е? и как работи??

Намерих списание и преглед за използването на буферна n носеща ДНК (ДНК на сперматозоидите) при трансформация на дрожди. от препратките към thow заключавам, че функцията на ДНК на сперматозоидите в трансформацията на дрожди е да намали свързването на мембраната с нашия плазмид. както знаем, дрождовата клетка е различна от бактериалната клетка. в дрождите, нейната мембрана може да свърже плазмид, така че ако вмъкнем плазмид в дрождите без добавяне на ДНК носител, така че ще загубим нашия плазмид в голям брой.

авторът на рецензията е Gietz.. n the journal by hinen.

не можах да намеря gietz journal :-(

ако искате препратките, можете да се свържете с мен на [email protected]

Здрасти,
Можете да прочетете тези статии. те ще ви помогнат за целите на използване на всички химични и биологични компоненти.
извършихме трансформация на дрожди, за да нокаутираме ген, и приложихме протоколи в тези статии. Така че работи.

1-) Високоефективна трансформация на дрожди с помощта на LiAc/SS носител ДНК/PEG метод


Защо се нуждаем от компетентни дрожди?

Настройките, споменати по-горе, включват въвеждането на чужда ДНК в дрождите в някакъв момент по време на експерименталния процес. Въвеждането на генни фрагменти (линейна ssDNA или плазмиди) се постига чрез трансформация на дрождевите клетки или чрез химични методи (например, литиев ацетат и полиетилен гликол (PEG)) или чрез електропорация.

Важно е, че ефективната трансформация на дрожди изисква започване с висококачествени компетентни дрождени клетки. Компетентността се отнася до способността на клетките да поемат свободен извънклетъчен генетичен материал (например плазмидна ДНК). Тази статия ще ви каже как точно да постигнете това и, да се надяваме, ще ви настрои добре по пътя към успеха на трансформацията на дрожди!


Трансформация на дрожди

Една от най-важните техники на съвременната молекулярна биология е способността да се въведе специфичен ген в организма и да има тази генетична информация, изразена от организма. Този процес, наречен генетична трансформация, изигра критична роля в историята на молекулярната биология и откритието, че ДНК е генетичният материал. Четирима учени, Грифит през 1920-те и Ейвъри, Маккарти и Маклауд през 1940-те, показаха, че очевидната "трансформация" на един бактериален тип в друг изисква ДНК и никаква друга биологична молекула.

Днес трансформацията не се ограничава само до бактериите и всъщност се използва рутинно от молекулярните биолози за манипулиране и изследване на поведението на гените. Този експеримент използва хлебна мая (Saccharomyces cerevisiae). Като моделна система, дрождите имат предимство пред бактериите, тъй като са еукариотен организъм с субклетъчна организация като тази на растенията и животните, включително хората. Трансформацията на дрожди включва няколко стъпки. След приключване на тези стъпки дрождите ще изразят новите характеристики или фенотип от добавената ДНК.

експеримент: Този експеримент използва щам на дрожди, който е дефектен в гена за синтез на аденин, ADE1. Метаболитният дефект в мутантите ги кара да изискват аденин за растеж и да натрупват червен пигмент, който кара колониите да изглеждат розови или червени на цвят. Когато тези ade1 мутантните дрожди се трансформират с нормалните ADE1 ген, те придобиват способността да растат при липса на аденин и да образуват нормални кремаво оцветени колонии.

Молекулите на ДНК, използвани в тази система за трансформация, са плазмиди, малки кръгли парчета ДНК. Те се държат по много начини като истински хромозоми, които носят гени в клетките, но плазмидите са много по-удобни. Има два вида плазмиди, носещи дрождите ADE1* ген, наличен за използване в този експеримент. Плазмидът YEpADE1 съществува в множество копия във всяка трансформирана дрождена клетка, но той е нестабилен и може да бъде загубен от трансформирана дрожди при относително висока честота. Плазмидът YCpADE1 съществува в едно копие в хаплоидна дрождена клетка, точно като нормалните хромозоми, и тъй като носи дрождена центромер, ще бъде стабилно сортиран в дъщерните клетки всеки път, когато дрождите се разделят. Всеки плазмид може да се използва ефективно за демонстриране на феномена на трансформация.

*клонираните ADE1 Генът, използван в тези плазмиди, е предоставен от д-р Дейвид Кабак от Медицинския и стоматологичен факултет на Университета в Ню Джърси.

Времева линия:

Ако инкубирате вашите култури при 30o C, ще можете да следвате този график при стайна температура, може да се наложи да удвоите времето между стъпките.

Предишният ден: 15 минути Подготовка
1-ви ден: 50 минути Трансформирайте клетките
5-ти ден: 20 минути Наблюдавайте и анализирайте резултатите

Материали:

  • Смес от плазмидна ДНК/носител, 1 ug (микрограм) YEpADE1 или YCpADE1 плюс 20 ug топлинно денатурирана ДНК от сперматозоиди от сьомга
  • 1-3 чинии МВ
  • 3-4 стерилни 1,5 mL микроцентрофужни епруветки
  • Стерилни пипети, микропипети или микрокапилярни епруветки
  • Стерилни клечки за зъби
  • Стерилизирани разпръсквачи за кламери или стъклени разпръсквачи, алкохол и пламък
  • Щам HA1L или HA1 (ade1)
  • YED чинии (1 на 4 -5 отбора)
  • Микроцентрофуга или клинична центрофуга
  • Водна баня (42o C) и сал от стиропор
  • Стерилна вода (дестилирана)
  • Стерилни разтвори:
    1. LiAc/TE (1x) разтвор
    2. TE (1x) разтвор
    3. 40% PLT разтвор

Приготвям се:

Съвети за учители
Технически съвет: Окачването трябва да е доста мътна. Разтворът LiAc/TE помага за повишаване на компетентността на дрождевите клетки (готови за трансформиране).
Технически съвет: YEpADE1 или YCpADE1 плазмидната ДНК се смесва с неспецифична, обработена с ултразвук или фрагментирана ДНК, която служи като носител. Тази ДНК носител прави трансформацията по-ефективна и вероятно помага за защита на плазмидната ДНК от клетъчни нуклеази, които иначе биха унищожили плазмида.
Технически съвет: Уверете се, че маята е добре суспендирана преди прехвърляне.
Технически съвет: 40% PLT разтвор помага да се натисне плазмидната ДНК в компетентните дрождеви клетки.

Преобразуване на клетките:

2. Подгответе ДНК / носеща ДНК епруветки. Към нова стерилна микроцентрофужна епруветка добавете 21 uL смес от плазмидна ДНК/носителя ДНК. Може да пожелаете да направите някои контролни тръби. Някои примери за възможни контролни тръби са
1) само носител на ДНК
2) само плазмидна ДНК
3) няма ДНК

3. Добавете дрожди към ДНК епруветките. Към ДНК епруветките, които сте подготвили, добавете 0,2 mL на епруветка от дрожди/LiAc/TE суспензия от стъпка 1. Изхвърлете остатъка от дрожди/LiAc/TE суспензия.

4. Към суспензията(и) ДНК/дрожди, добавете 1,2 mL 40% разтвор на PLT на епруветка.

5. Затворете плътно епруветката и разбъркайте добре, като обърнете епруветката няколко пъти.

6. Инкубирайте тази смес при стайна температура за приблизително 20 минути.

7. Топлинен шок на суспензията(ите) ДНК/дрожди/PLT за минимум 5 минути (максимум 15 минути) във водна баня с температура 42oC.

8. Центрофугирайте суспензията, за да пелетирате дрождевите клетки. (Съвети за учители)
Технически съвет: TE решението се използва за замяна на LiAc и PLT решенията за покритие.
Технически съвет: MV средата осигурява само минимални хранителни вещества, енергиен източник и витамини. MV не доставя аденин.

Покриване на клетките:
9. Изхвърлете супернатантата (течен разтвор) от микрофужната(ите) епруветка(и).

10. Ресуспендирайте пелетираните дрождеви клетки чрез добавяне на 1 mL ТЕ разтвор. Потупайте внимателно, използвайте стерилна клечка за зъби или вихър, за да суспендирате клетките в ТЕ разтвора.

11. Суспензия на плака върху MV агар. От всяка епруветка за суспензия на дрожди използвайте свежа стерилна пипета, за да прехвърлите 0,2 mL суспензия от дрожди във всяка от една или две MV (селективна среда) плаки. Използвайте свеж стерилен разпределител, за да разпределите клетките от всяка епруветка равномерно по повърхността на агара. Съвети за учители
12. Инкубирайте плаките в продължение на 3-5 дни при стайна температура или в инкубатор при 30oC.

Наблюдавайте и анализирайте резултатите:

1. Кои клетки могат да растат върху MV (тези със или без ADE1 плазмид)? Обяснете резултатите си по отношение на присъствието или отсъствието на плазмида.

2. Сравнете вашата плазмидна ДНК плоча с други в класа. Всички плочи имаха ли еднакъв брой колонии? Всички колонии бяха с един и същи цвят? Едни и същи ли бяха плочите YCpADE1 и YEpADE1? Напишете обяснение за всички разлики, наблюдавани във вашия клас.

3. Някоя от контролните плаки имала ли е колонии? Ако все пак предложат възможно обяснение.


Трансформация на дрожди

Този протокол се основава на Gietz, R.D. и R.A. Уудс. (2002) ТРАНСФОРМАЦИЯ НА МАШИ ПО МЕТОДА НА ЛИАК/СС НОСИТЕЛ ДНК/ПЕГ. Методи в ензимологията 350: 87-96. Някои стъпки от този протокол се основават на информация, получена от:

Този протокол е обобщен и не трябва да се счита за оптимален за всички щамове, условия и приложения. Някои аспекти на този протокол може да се наложи да бъдат променени значително, за да отговарят на вашите конкретни нужди. Работи за проста трансформация, насочване към дрожди, възстановяване на GAP и мултиплазмидни трансформации за двухибридни.

1) Намажете или залепете маята върху YAPD за 24-48 часа. Може да се използва и дрожди от по-стари чинии (3 месеца? при 4 градуса), ако ефективността не е проблем и щамът съдейства.

2) Инокулирайте 2 x 3-5 ml култури в 2xYAPD или SC среда (15 ml епруветки с капачка) от прясната ивица и инкубирайте O/N 30 градуса, 200 rpm. Може да се наложи SC медиите да бъдат засадени по-силно (или може да са необходими повече епруветки).

YAPD може да бъде заменен с 2xYAPD, но ефективността ще спадне малко и дрождите ще отнеме повече време, за да растат.

1) Предварително затоплете 50 ml 2xYAPD до 30 градуса в колба от 500 ml (най-малко 10 минути). Включете 42 градуса водна баня (отнема 30 минути или повече).

2) Разредете O/N култура 1:10 във вода и вземете OD при 600 nm. Използвайте 2xYAPD (или YAPD или SC, когато е подходящо), разредени 1:10 във вода като празна проба. Разредената култура обикновено има OD между 0,1 и 1,0.

3) Разредете културата до приблизително 0,1 OD в 50 ml предварително затоплена 2xYAPD и инкубирайте 3-6 часа, докато OD достигне 1,0 (или близо). Степента на отглеждане на дрожди варира, така че бъдете готови да изчакате. Обикновено отнема 5-6 часа, но може да отнеме доста повече време.

ПРИМЕР: Разредената култура в стъпка 2 има OD или 0,2, така че OD на културата е 2,0. За да получите OD от приблизително 0,1 за стъпка 3, трябва да добавите 2,5 ml култура към вашите предварително затоплени 50 ml 2xYAPD (20x разреждане). Очевидно не е точно, защото сега ще имате 52.5ml вместо 50ml, но е достатъчно близо. Ако искате точно, можете просто да извадите 2,5 ml 2xYAPD от колбата, преди да добавите вашата 2,5 ml култура, но не е необходимо.

4) Пелети 3000 rpm, 10 минути при RT в RT6000 или подобна центрофуга.

5) Докато въртите мая, сварете ДНК на спермата на сьомга за 5 минути с вряща капачка и охладете върху лед. Използвайте 3-4 пъти (съхранение при -20) и вземете нова туба. Не кипете отново и отново.

6) Ресуспендирайте в 1ml ddH2O и прехвърлете в 1,5ml епруветка.

7) Разбърквайте 1 мин. или докато маята е в суспензия (без бучки).

8) Пелети при максимална скорост, 30 секунди, RT и ресуспендирайте в 1ml ddH2O чрез завихряне, както преди. 100ul ще бъдат използвани за всяка трансформация, така че има достатъчно дрожди за 10 трансформации.

9) Прехвърлете 100 ul дрожди в отделна епруветка от 1,5 ml за всяка трансформация и пелети при максимална скорост, 30 секунди, RT и отстранете супернатантата.

10) За всяка трансформация съставете следното (основен микс или отделно):

50 ul от 2 mg/ml ДНК сперматозоиди от сьомга

34 ul или вашия плазмид(и) + вода (1 ul бактериална минипреп ДНК е достатъчно)

11) Добавете трансформационната смес(и) към пелетите с мая от стъпка #9 и разклатете на вортекс 1 минута или докато дрождите са в суспензия (без бучки).

12) Поставете маята на 42 градуса за 40 минути. За най-добра ефективност оптималното време на шока трябва да се определи емпирично и може да варира от 10 минути до 60 минути. За проста трансформация на плазмид с единична селекция 20-30 минути обикновено работи добре.

13) Пелети при максимална скорост, 30 секунди, RT и отстранете трансформационната смес.

14) Добавете 1ml ddH2O и използвайте 1ml накрайник за пипета, за да разбъркате клетките в разтвор. Ако е необходимо, пипетирайте маята нагоре-надолу много внимателно.

15) Поставете 200 ul върху подходящи 100 mm или 150 mm селективни плаки и отглеждайте 3-4 дни при 30 градуса. *Вместо 1ml в стъпка 14 можете също да суспендирате маята в 400ul и да поставите цялото количество върху една 150mm чиния, ако желаете.

Ефективността варира значително в зависимост от щама и трансформиращата се ДНК. Може да варира от 1吆^3 до 1吆^5 (или така) колонии на ug входяща ДНК (за плазмидна ДНК).

10 г екстракт от бактоквас

100 mg аденин хемисулфат

Автоклавирайте 20 минути на течен цикъл.

Селективната среда ще варира в зависимост от щама и приложението.

2 mg/ml в TE. Сигма D1626. Направете 100 ml в колба с помощта на магнитна бъркалка. Отнема 2-4 часа, за да се разтвори. Аликвотна част в епруветки от 1,5 ml (1 ml/епруветка).

Поставете 50 g полиетилен гликол, MW 3350 (Sigma) в стъклена чаша от 150 ml и добавете 35 ml ddH20. Разбърква се 1-2 часа с магнитна бъркалка, докато се разтвори. q.s. до 100 ml и продължавайте да бъркате поне 10 минути, за да се смеси. Филтрирайте, като използвате 0,45 um филтър и аликвотна част в 15 ml конуси (10 ml всяка) и съхранявайте при стайна температура.

1,0 М литиев ацетат. Няма нужда от pH.

Тим Шедл, д-р
Катедра по генетика
Campus Box #8232
Медицински факултет на Вашингтонския университет
4566 Scott Ave.
Сейнт Луис, МО 63110


Високоефективна трансформация на дрожди с помощта на LiAc/SS носител ДНК/PEG метод

Тук описваме високоефективна версия на литиевия ацетат/едноверижна ДНК/PEG метод за трансформация на Saccharomyces cerevisiae. Този метод в момента дава най-висока ефективност и добив на трансформанти, въпреки че е наличен по-бърз протокол за малък брой трансформации. Процедурата отнема до 1,5 часа, в зависимост от продължителността на топлинния шок, след като дрождовата култура е отгледана. Този метод е полезен за повечето изисквания за трансформация.


КЛОНИРАНЕ НА РЕКОМБИНАНТНО ДНК

СЮЗЪН Дж. КАРЧЪР, по молекулярна биология, 1995 г

Трансформационни процедури

Изследователи, изследващи ефективността на трансформацията в Е. coli са отбелязали променливост в способността за трансформиране на различни препарати на един и същ плазмид, както и променливост в различните партиди от Е. coli клетки (Conley and Saunders, 1984). Conley и Saunders (1984) показаха, че линеен pBR322 плазмид се трансформира Е. coli при 10 2 до 10 3 по-ниска честота, отколкото при ковалентно затворена свръхнавита pBR322 плазмидна ДНК. Плазмидът се линеаризира чрез срязване с рестрикционна ендонуклеаза, която се разрязва веднъж в плазмида. Dagert и Ehrilich (1979), използвайки 0.1 М CaCl2 да се направи компетентен Е. coli клетки, наблюдават, че ефективността на трансформация се увеличава, когато клетките се съхраняват върху лед, въпреки че клетъчната жизнеспособност намалява с периода на съхранение върху лед. В своите експерименти те определят честота на трансформация от 2 × 10 7 трансформанти/μg pBR322, използвайки прясно приготвени компетентни Е. coli клетки. Честотата на трансформация на клетките, съхранявани върху лед за 24 часа, е шест пъти по-голяма и по-висок процент жизнеспособни клетки (20%) са компетентни. Жизнеспособността на клетките намалява постоянно по време на съхранението върху лед. Трансформируемостта на клетките достига максимум при 24 часа съхранение на лед и намалява с по-продължителна инкубация на лед.

Иноуе et al. (1990) внимателно изследва факторите, които влияят върху ефективността на трансформацията в Е. coli. Те откриха, че растежът на Е. coli клетки при по-ниска температура води до по-висока ефективност на трансформация. Те определят оптималната температура на растеж на клетките да бъде 18°C, когато се отглеждат до A600 от 0,75. Времето за достигане на такава плътност при по-ниска температура може да бъде 2 дни. Използвайки своята процедура за създаване на компетентни клетки, те получават честоти на трансформация от 1–3 × 10 9 трансформанти/μg pBR322 ДНК. Такива честоти са сравними с тези, получени при електропорация. (Електропорацията използва импулс на електричество, за да създаде пори в клетъчната мембрана. ДНК може да влезе в клетката по този начин.) Тези високи ефективности са необходими за създаване на пълна библиотека на сДНК от сложен геном.

Ханахан се стреми да разбере естеството на процеса на трансформация в Е. coli по-подробно и за подобряване на ефективността на трансформацията в Е. coli. Ханахан разработи процедури за трансформация, които за определени щамове на Е. коли, увеличава ефективността на трансформацията 100- до 1000 пъти повече от ефективността със стандартния CaCl2 лечение. Модифицираните процедури за трансформация на Ханахан включват растежа на клетките на 10-20 mМ Mg 2+, последвано от комбиниране на ДНК и клетки в присъствието на един от тези допълнителни компоненти: 45 mМ Mn 2+ 10 mМ Ca 2+ , 100 mМ Rb 2+, или K + 7% диметилсулфоксид (DMSO), 75 mМ дитиотреитол (DTT), или 3 mМ хексамин кобалт(III) хлорид. Ханахан отбелязва, че условията на култивиране на бактериите (растеж в голяма колба, с голямо съотношение повърхност към обем и енергично разбъркване без образуване на пяна) са важни за постигането на висока ефективност на трансформация, но тези процедури не повишават ефективността на трансформация на всичко Е. coli щамове, които е изучавал. Той успя да получи 5 × 10 8 трансформанти/μg плазмид pBR322 или 1 трансформирана клетка на 400 плазмидни молекули.

Проучванията на Ханахан предполагат три роли, които двувалентните катиони могат да играят в подпомагането на трансформацията: (1) Двувалентните катиони защитават отрицателните заряди върху ДНК (от фосфатните групи) и от външната страна на клетката (от фосфолипиди на клетъчната повърхност и липополизахариди), така че ДНК може да влезе в тясна връзка с клетката по-лесно (2) Комбинацията от ниска температура и двувалентни катиони може да подпомогне кристализацията на участъците на мембраната, за да направи каналите за поглъщане на ДНК по-достъпни. (3) Двувалентните катиони могат помагат за реорганизирането на липополизахаридите далеч от каналите, които обикновено пазят.

Използването на тези протоколи за трансформиране Е. coli клетките са ценен инструмент за възможно клониране на рекомбинантна ДНК. Разработени са алтернативни методи за въвеждане на ДНК в бактериалната клетка и в еукариотните клетки. За преглед на някои от тези методи вижте Karcher (1994).


Печели ли сте или гледали ли сте някой да пече хляб? Ако е така, тогава знаете, че маята е много важна съставка за хляб, тъй като служи като набухвател и кара хляба да втаса. Може да се изненадате да чуете, че дрождите всъщност са жив организъм! По-конкретно, дрождите са едноклетъчни еукариотни микроорганизъм и по този начин съдържа сложни вътрешни клетъчни структури, подобни на тези на животните и растенията. Научното му име е Saccharomyces cerevisiae (Фигура 1). Повечето еукариоти са многоклетъчни организми. Човешките клетки, например, са еукариотни клетки. Ето защо маята е важна не само за печене на хляб, но също така играе важна роля в биологичните изследвания. Поради сходството си с човешките клетки, дрождите са се превърнали в мощен моделен организъм за биохимични и генетични изследвания. Например, много човешки гени, за които е известно, че имат роля в болестите, имат аналози в дрождите. Това позволява на учените да тестват нови лекарства върху дрождевите клетки или да изследват ефектите от определени генни мутации. Като едноклетъчен организъм, дрождите имат допълнителната полза, че могат да бъдат култивирани и манипулирани, като се използват стандартните техники, прилагани към бактерии.


Фигура 1. една мая (Saccharomyces cerevisiae) култура, наблюдавана със сканиращ електронен микроскоп.

За да се изследват биохимичните процеси в Saccharomyces cerevisiae, често е необходимо да се промени оригиналния му генетичен материал, като например въвеждане на определена мутация в ген. Това се постига чрез използване генното инженерство техники, като молекулярно клониране или редактиране на генома. Тези техники позволяват на изследователите да нокаутират или изтрият конкретен ген, за да проучат неговата специфична функция или да добавят нови гени в клетка, за да променят нейните свойства или да създадат нови метаболитни пътища. Създаване на a генетично модифициран организъм (ГМО) включва множество техники и няколко стъпки. Техниките, прилагани към дрождите, са много сходни с техниките, прилагани към бактериалните клетки. Въз основа на целта си на изследване, генните инженери обикновено първо идентифицират или избират гена, който искат да модифицират, вмъкнат или изтрият. В следващата стъпка всички ДНК фрагменти, необходими за модификацията на дрождовата клетка, трябва да бъдат сглобени и след това въведени в клетката. Наричат ​​се ДНК молекули, които се образуват чрез лабораторни методи за създаване на нови ДНК последователности рекомбинантна ДНК.

Техниката за създаване и сглобяване на рекомбинантни ДНК молекули се нарича молекулярно клониране. Нови или променени ДНК последователности могат да бъдат синтезирани или създадени чрез използване на един от няколко метода за клониране. Един от тези методи включва рязане и поставяне на съществуващи ДНК парчета заедно. За да изрежете съществуващи ДНК фрагменти, рестрикционни ензими често се използват, които са в състояние да разкъсат ДНК на определено място. Веднъж разцепени, могат да се вмъкнат нови или променени ДНК фрагменти или специфични интересни гени. Ензимът ДНК лигаза след това се използва за сливане на отделните ДНК фрагменти на рекомбинантната ДНК заедно. Следващата стъпка е въвеждането на новосъздадената рекомбинантна ДНК в клетката на дрождите. При молекулярно клониране това обикновено се прави с a вектор. Векторите са ДНК молекули, които носят рекомбинантна ДНК в клетката гостоприемник. Веднъж вътре в клетката гостоприемник, въведената ДНК може да бъде репликирана и/или експресирана. Най-често използваните вектори са плазмиди (Фигура 2). Плазмидите са кръгови ДНК молекули, които естествено се срещат в дрожди и бактерии. Те обикновено са малки, отделени от хромозомната ДНК на клетката и често носят гени, които осигуряват полза за клетката, като резистентност към антибиотици. За генното инженерство се създават изкуствени плазмиди и целевият ген или ДНК последователност се включва в плазмидната ДНК. По този начин целият плазмид, включително рекомбинантната ДНК, се въвежда в клетката на дрождите.

Първата стъпка показва рекомбинантния плазмид, който има целевия ген, включен в кръговата му структура. Втората стъпка показва плазмида със стрелка, сочеща към схематичен чертеж на дрождена клетка. Дрождевата клетка съдържа плазмида с целевия ген. Третата стъпка показва схематичен чертеж на селективна агарова плоча. Две клетки от дрожди, които включват плазмидите на целевия ген, са показани над агаровата плоча със стрелки, които сочат към агаровата плоча. Петата и последна стъпка показва изглед отгоре на плоча с агар с много кръгове върху нея, които представляват дрождевите клетки.


Фигура 2. Схематичен чертеж, показващ някои от стъпките, свързани с генерирането на генетично модифицирани дрожди.

Действителната модификация на генетичния материал на дрождите се случва, когато рекомбинантната ДНК е интегрирана в клетката на дрождите. Поемането на плазмида в клетката на дрожди се нарича трансформация. В лабораторията трансформацията може да се задейства с помощта на множество методи, като химическа обработка на дрождевите клетки или електропорация. Електропорацията използва импулси с високо напрежение за увеличаване на пропускливостта на клетъчните мембрани, което позволява на чужда ДНК да влезе в клетката. По време на трансформацията не всяка дрождена клетка ще поеме плазмида, поради което успешно трансформираните дрождени клетки трябва да бъдат разграничени от неуспешните. За тази цел плазмидите, използвани за молекулярно клониране, обикновено съдържат допълнителен селективен маркер освен целевия ген или променена ДНК последователност. Този маркер, който често е ген за резистентност към антибиотици, позволява селективен растеж на генетично модифицираните дрожди върху агарови плочи които съдържат специфични антибиотици. В много случаи части от плазмидната ДНК на успешен трансформант се секвенират, за да се потвърди, че правилната ДНК последователност присъства в този конкретен клон.

Генното инженерство не се ограничава само до дрожди или бактерии. По подобен начин могат да се променят и геномите на растенията и животните. Много селскостопански растения като царевица, рапица или соя вече са генетично конструирани, за да подобрят производителността си. Друго приложение на ГМО е във фармацевтичната индустрия. Днес много лекарства, като инсулин за диабетици или определени антитела, се произвеждат от генетично модифицирани бактерии или растения. Учените проучват и производството на други търговски ценни продукти, като паякова коприна, биогорива или ваксини.

В този проект ще създадете своя собствена генетично модифицирана мая. По-конкретно, вие ще направите Saccharomyces cerevisiae светят чрез въвеждане на a зелен флуоресцентен протеинов ген (gfp) в неговата ДНК. GFP произхожда от медуза и често се използва в биотехнологиите за маркиране на определени клетки или като репортерен ген, който показва дали клетката експресира определен протеин. В този експеримент ще трансформирате дрождев плазмид, който съдържа gfp ген в Saccharomyces cerevisiae. Ще направите тази трансформация с различни щамове дрожди. Има много различни щамове дрожди, включително хлебна мая или бирена мая (която се използва за производство на вино или за варене на бира). Ще проучите дали всеки от различните щамове е в състояние да поеме GFP плазмида по време на трансформацията. Мислите ли, че можете да накарате всички щамове дрожди да флуоресцират под UV светлина?


Отвъд геномната интеграция–Мултиплексиране за оптимизиране на пътя

Въвеждането на хетероложни гени в организма гостоприемник е ключово за изграждането на хетероложни пътища и производството на целеви продукти. Въпреки това, оптимизирането на получените конструирани пътища и дори естествени пътища също е от решаващо значение за развитието на ефективни фабрики за микробни клетки. По този начин делециите на гени, разрушаването на гените и репресията или свръхекспресията на генната експресия са важни приложения в обхвата на геномното инженерство (Ko et al., 2020). Що се отнася до геномната интеграция, мултиплексирането на такива приложения също има потенциал да ускори процеса на разработване на щамове и технологиите CRISPR/Cas9 също ще се окажат ценни инструменти в този контекст.

Едновременно мултигенно разрушаване в S. cerevisiae беше постигнато за първи път чрез хомологично-интегриран CRISPR-Cas (HI-CRISPR) (Bao et al., 2015). За да се разрушат целевите гени, хомоложна донорна ДНК от 100 bp, съдържаща делеция от осем bp и последователност на протоспейсърния мотив (PAM), беше използвана като мутагенизиращ фрагмент, който беше вмъкнат между crRNA последователности в масива на crRNA. CrRNA масивът, съдържащ множество crRNA последователности и разрушаващи донори, и tracrRNA бяха експресирани под контрола на различни промотори в единичен плазмид всичко в едно, както е илюстрирано на Фигура 7А. След обработка на масива crRNA от нуклеази гостоприемници (неизвестни) и RNase III, tracrRNA и crRNAs образуват комплекс за насочване на подобрен вариант Cas9, iCas9, който беше открит по време на изследването. Използвайки подхода HI-CRISPR, триплексното разрушаване на CAN1, ADE2, и LYP1 гените се постига с 83% ефективност след 4 дни инкубация в синтетична среда за отпадане. В допълнение, едновременно нарушаване на ATF2, GCY1, и YPR1 гените се постига със 100% ефективност след 6 дни инкубация.

Фигура 7. (А) HI-CRISPR система, която използва единичен вектор "всичко в едно" за експресиране на iCas9, масива crRNA, tracrRNA и мутагенизиращ донорен фрагмент за мулти-генно разрушаване. (Б) Метод за редактиране на множество гени, включващ експресия на мулти-gRNA касети чрез плазмид, конструиран чрез клониране на USER. Cas9 беше изразен от домакина.

Подходът HI-CRISPR също беше използван за разрушаване на четири гена в диплоидни и триплоидни щамове на дрожди, което води до делеции с осем алела и дванадесет алела, съответно (Lian et al., 2018). Вместо да експресират crRNA, както в дизайна на HI-CRISPR, gRNAs бяха експресирани с различен брой копия. С високо копие на експресионни плазмиди на gRNA (� копия/клетка) беше постигната 100% ефективност на делеция на ген за четири гена, HIS3, TRP1, LEU2, и URA3 както в диплоиден щам на дрожди (Етанол червено), така и в триплоиден щам на дрожди (ATCC 4124).

Въпреки че четири гена бяха ефективно разрушени с помощта на подхода HI-CRISPR (Lian et al., 2018), ефективността на разрушаването на гена намаля драстично, когато целевата crRNA последователност беше поставена на пета позиция в масива crRNA (Bao et al., 2015). В по-късно проучване обаче Jakočinas et al. (2015) успяха да преодолеят това затруднение, когато се насочиха към пет различни локуса в генома на дрождите за едновременно редактиране за увеличаване на производството на мевалонат. Четири гена BTS1, YPL062W, YJL064W, и ROX1, бяха нарушени чрез включване на стоп кодон в PAM последователността на гените. Промоторът на пети ген, ERG9P, също беше съкратен, за да се намали експресията му. Индивидуални gRNA експресиращи касети, съдържащи техни собствени промоторни и терминаторни последователности, бяха сглобени с помощта на USER клониране за конструиране на мулти gRNA експресионен плазмид. След това Cas9 се експресира от отделен плазмид (Фигура 7В). Изследователите съобщават за 100% ефективност на редактиране на петкратен геном, използвайки метода. Производството на мевалонат е увеличено до 10 μM в получения оптимално проектиран щам, което представлява 41-кратно подобрение в сравнение с дивия тип (Jakočinas et al., 2015).

Csy4 е ендорибонуклеаза на Pseudomonas aeruginosa експресиран за биогенеза на crRNA (Haurwitz et al., 2012). Въпреки че за първи път е използван за мултиплексно редактиране на генома на клетки на бозайници (Nissim et al., 2014), Ferreira et al. (2018) демонстрира своята приложимост към S. cerevisiae. Csy4 беше използван за увеличаване както на множествените делеции, така и на многократната регулация на целеви гени в S. cerevisiae. Ендорибонуклеазата е в състояние да насочва и отрязва определена стволова бримка, състояща се от 28 bp нуклеотидна последователност (Haurwitz et al., 2012). Изследователите епизомно експресират четири gRNA, като целевата област Csy4 е поставена между тях, под контрола на един промотор (РНК полимераза III промотор, SNR52), в щам на дрожди, експресиращ Csy4 и Cas9, както е показано на фигура 8А. Четворно заличаване на четири гена, FAA1, FAA4, TES1, и POX1, беше постигната с 96% ефективност при използване на Csy4, в сравнение с само 50% ефективност за двойно заличаване на ген в отсъствието на Csy4. A similar approach was also applied for the upregulation of three genome-integrated GFP genes under the control of three different promoters, HMG1, ACS1, и OLE1 (Ferreira et al., 2018). However, a dCas9-VPR activator was expressed by the gRNA expressing plasmid, whilst Csy4 was expressed by a second plasmid in the strain. Three different combinations of promoter targeting gRNAs were investigated leading to a two-fold increase in GFP expression compared to those strains not expressing Csy4.

Фигура 8. (А) Csy4-based multi-gene editing method. gRNAs were expressed from a 2 μ plasmid while Cas9 and Csy4 were expressed by the host. Csy4 cleaved 28 bp stem-loop to release single gRNAs in the host. (Б) GTR-CRISPR method which benefits from tRNA sequences inserted between gRNAs. Up to eight genes could be edited using this method. All elements, multi-gRNAs and Cas9, were expressed by a single plasmid and endogenous RNase P and RNase Z were used to process tRNA containing transcripts to release gRNAs.

A maximum of eight efficient multi-gene disruptions was recently achieved using a gRNA-tRNA array for CRISPR-Cas9 (GTR-CRISPR) method. Eight genes (CAN1, ADE2, LYP1, TRP2, FAA1, FAA4, POX1, TES1) were simultaneously disrupted with 87% efficiency when optimal gRNA sequences were used (Zhang et al., 2019). In the GTR-CRISPR design, a tRNA Gly sequence was inserted between each gRNA and two SNR52 promoters were used to each transcribe four of the eight gRNAs (Figure 8B). Endogenous tRNAs were processed by two enzymes RNase P and RNase Z, following transcription in a similar way to the Csy4-aided method. A single and complete plasmid including both the multiple gRNAs and Cas9 protein was constructed via Golden Gate assembly. To further streamline the method, an alternative approach, Lightning GTR-CRISPR, was also developed by the researchers. Without pre-assembly of the DNA fragments, the Golden Gate reaction mix was directly transformed into the yeast for in vivo сглобяване. Through the expression of two gRNAs, under SNR52 promoters, 96% and 60% multiple disruption efficiencies were achieved for four (CAN1, ADE2, LYP1, TRP2) and six genes (CAN1, ADE2, LYP1, TRP2, FAA1, FAA4), съответно. However, a dramatic decrease in efficiency was reported for the simultaneous disruption of eight genes.

The construction and simultaneous expression of multiple gRNAs are critical to multiplex genome engineering. Jakočinas et al. (2015) constructed a plasmid expressing five different gRNAs using USER cloning. However, as a USER cloning site was first integrated into a plasmid containing a single gRNA expression cassette, an additional step was required for the construction of a multiple gRNA expressing plasmid. This multi-gRNA expressing plasmid was co-transformed with donor DNAs into a Cas9-expressing yeast strain. For the HI-CRISPR method, on the other hand, Bao et al. (2015) made use of Golden Gate dependent assembly to construct an all-in-one HI-CRISPR system which expresses all of the required elements, donor DNA, crRNAs, tracrRNA and Cas9, in a single plasmid. This approach could therefore be applied in a yeast strain without the need for Cas9 expression. In an alternative method, Ferreira et al. (2018) expressed one more element, Csy4, to optimize multiple gRNAs expression and facilitate the expression of all gRNAs using a single promoter. Although the approach demonstrated good potential for the stable expression of multiple gRNAs, a maximum of four gRNAs were simultaneously integrated in the study. Further research is therefore needed to investigate its application for higher numbers of gRNA sequences. The GTR-CRISPR method appears to be the most efficient approach for the simultaneous disruption of large numbers of genes (Zhang et al., 2019). A modified version of this method was also utilized for the deletion of eight genes (four genes per round) in yeast lipid metabolism for increased free fatty acid production. As endogenous tRNA processing enzymes were used and Cas9 was expressed episomally, like HI-CRISPR, this method could theoretically be applied to any yeast strain without the need for genomic integrations. Nevertheless, all of the mentioned approaches present promising solutions for high-efficiency, simultaneous multiple gene disruptions or deletions.

Csy4-aided multiple up-regulation of triple targets was also shown in the aforementioned study (Ferreira et al., 2018). In addition to multiple gene deletions, multiple up-regulation or down-regulation of target genes can be very useful for the fine-tuning of metabolic pathways and production of target products. Lian et al. (2017) developed a tri-functional CRISPR system named CRISPR-AID to simultaneously up-regulate, down-regulate and delete three different target genes in the yeast genome. Researchers integrated homologous donor sequences into gRNA cassettes via the HI-CRISPR method and three CRISPR systems, one for activation, one for interference and one for deletion, were designed. The dCas9-VPR complex was used for up-regulation, dCas9-MXI1 complex for down-regulation and a catalytically active Cas9 was used for deletion. Firstly, the simultaneous five-fold activation of RFP, mCherry, five-fold interference of yellow fluorescent protein, mVenus and deletion of ADE2 gene with more than 95% efficiency was achieved using the CRISPR-AID method. Production of β-carotene was also increased 2.8-fold by simultaneously overexpressing a HMG1 gene, downregulating an ERG9 gene and deleting a ROX1 gene in a single CRISPR-AID genome engineering step.

Recently, seven genes in S. cerevisiae were simultaneously down-regulated (Ni et al., 2019), this is the greatest number of simultaneous down-regulation achieved in a single step in the species. To increase β-amyrin production, ADH1, ADH4, ADH5, ADH6, CIT2, MLS1, и ERG7 genes were down-regulated using a multi-gRNAs expression plasmid in a yeast strain expressing dCas9 (dead Cas9). A plasmid containing seven cassettes, each expressing one of the gRNAs along with its promoter and terminator, separated by random 20 bp sequences was constructed. Using this method alone, β-amyrin production was increased by 42% to 60 mg/L.

The methods discussed in this section highlight the applicability of multiple genome editing techniques for gene deletion, disruption, up-regulation or down-regulation. Such edits allow significant improvements in the productivity of metabolic pathways to be achieved without further gene integrations. Gene integrations increase both the metabolic burden on the host and the cost of the project. Minimizing the number of gene integrations, whenever possible, through the use of alternative approaches to metabolic pathway optimization is therefore an effective approach.


    Audergon PNCB, Catania S, Kagansky A, et al.: Epigenetics. Restricted epigenetic inheritance of H3K9 methylation. Science. 2015 348(6230): 132–135. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Bähler J, Wu JQ, Longtine MS, et al.: Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.Yeast. 1998 14(10): 943–951. PubMed Abstract | Publisher Full Text Ciccaglione KM: Adaptation of CRISPR/Cas9 to improve the experimental utility of the model system Schizosaccharomyces pombe. Master’s thesis Rutgers University. 2015. Publisher Full Text Cong L, Ran FA, Cox D, et al.: Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013 339(6121): 819–823. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Fantes PA, Hoffman CS: A Brief History of Schizosaccharomyces pombe Research: A Perspective Over the Past 70 Years. Генетика. 2016 203(2): 621–629. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Fernandez R, Berro J: Use of a fluoride channel as a new selection marker for fission yeast plasmids and application to fast genome editing with CRISPR/Cas9. Yeast. 2016 33(10): 549–557. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Hayashi A, Tanaka K: Short-Homology-Mediated CRISPR/Cas9-Based Method for Genome Editing in Fission Yeast. G3 (Bethesda). 2019 9(4): 1153–1163. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Hentges P, Van Driessche B, Tafforeau L, et al.: Three novel antibiotic marker cassettes for gene disruption and marker switching in Schizosaccharomyces pombe.Yeast. 2005 22(13): 1013–1019. PubMed Abstract | Publisher Full Text Hottinger-Werlen A, Schaack J, Lapointe J, et al.: Dimeric tRNA gene arrangement in Schizosaccharomyces pombe allows increased expression of the downstream gene. Нуклеинови киселини Res. 1985 13(24): 8739–8747. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Hsu PD, Lander ES, Zhang F: Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014 157(6): 1262–1278. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Jacobs JZ, Ciccaglione KM, Tournier V, et al.: Implementation of the CRISPR-Cas9 system in fission yeast. Nat Commun. 2014 5: 5344. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al.: A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012 337(6096): 816–821. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Lock A, Rutherford K, Harris MA, et al.: PomBase 2018: user-driven reimplementation of the fission yeast database provides rapid and intuitive access to diverse, interconnected information. Нуклеинови киселини Res. 2019 47(D1): D821–D827. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Longmuir S, Akhtar N, MacNeill SA: Unexpected insertion of carrier DNA sequences into the fission yeast genome during CRISPR-Cas9 mediated gene deletion. BMC Res Notes. 2019 12(1): 191. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Mata J, Lyne, R, Burns G, et al.: The transcriptional program of meiosis and sporulation in fission yeast. Нат Женет. 2002 32(1): 143–147. PubMed Abstract | Publisher Full Text Moreno S, Klar A, Nurse P, et al.: Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.Методи Ензимол. 1991 194: 795–823. PubMed Abstract | Publisher Full Text Orthwein A, Noordermeer SM, Wilson MD, et al.: A mechanism for the suppression of homologous recombination in G1 cells. Nature. 2015 528(7582): 422–426. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Ragunathan K, Jih G, Moazed D, et al.: Epigenetics. Epigenetic inheritance uncoupled from sequence-specific recruitment. Science. 2015 348(6230): 1258699. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Rodríguez-López M, Cotobal C, Fernández-Sánchez O, et al.: A CRISPR/Cas9-based method and primer design tool for seamless genome editing in fission yeast [version 3 peer review: 2 approved]. Wellcome Open Res. 2016 1: 19. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Ryan OW, Skerker JM, Maurer MJ, et al.: Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. eLife. 2014 3: e03703. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Sabatinos SA, Forsburg SL: Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe.Методи Ензимол. 2010 470: 759–795. PubMed Abstract | Publisher Full Text Sorida M, Hirauchi T, Ishizaki H, et al.: Regulation of ectopic heterochromatin-mediated epigenetic diversification by the JmjC family protein Epe1. PLoS Genet. 2019 15(6): e1008129. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Torres-Garcia S, Yaseen I, Shukla M, et al.: Epigenetic gene silencing by heterochromatin primes fungal resistance. Nature. 2020 585(7825): 453–458. PubMed Abstract | Publisher Full Text Torres-Garcia S: SpEDIT: A fast and efficient CRISPR/Cas9 method for fission yeast [Data set]. Zenodo. 2020. http://www.doi.org/10.5281/zenodo.4247568 Trickey M, Grimaldi M, Yamano H, et al.: The anaphase-promoting complex/cyclosome controls repair and recombination by ubiquitylating Rhp54 in fission yeast. Mol Cell Biol. 2008 28(12): 3905–3916. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Wang J, Reddy BD, Jia S, et al.: Rapid epigenetic adaptation to uncontrolled heterochromatin spreading. eLife. 2015 4: e06179. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Yamagishi Y, Sakuno T, Shimura M, et al.: Heterochromatin links to centromeric protection by recruiting shugoshin. Nature. 2008 455(7210): 251–255. PubMed Abstract | Publisher Full Text Zhang XR, He JB, Wang YZ, et al.: A Cloning-Free Method for CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing in Fission Yeast. G3 (Bethesda). 2018 8(6): 2067–2077. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Zhao Y, Boeke JD: Construction of Designer Selectable Marker Deletions with a CRISPR-Cas9 Toolbox in Schizosaccharomyces pombe and New Design of Common Entry Vectors. G3 (Bethesda). 2018 8(3): 789–796. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text Zofall M, Yamanaka S, Reyes-Turcu FE, et al.: RNA elimination machinery targeting meiotic mRNAs promotes facultative heterochromatin formation. Science. 2012 335(6064): 96–100. PubMed Abstract | Publisher Full Text | Free Full Text

Looking for the Open Peer Review Reports?

They can now be found at the top of the panel on the right, linked from the box entitled Open Peer Review. Choose the reviewer report you wish to read and click the 'read' link. You can also read all the peer review reports by downloading the PDF.