Информация

Колко червени кръвни клетки на мишки трябва да разредя преди да преброя?

Колко червени кръвни клетки на мишки трябва да разредя преди да преброя?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Чудя се колко червени кръвни клетки трябва да разредя с колко PBS, преди да разчитам на хемоцитометър с трипаново синьо


Препоръчваме да добавите 0,1 mL изходен разтвор на трипаново синьо към 1 mL клетки (крайна концентрация 0,04% w/v). Крайните концентрации могат да варират от 0,0,04% до 0,2% (w/v) в зависимост от пробата и инструментите.

Да, можете да намерите протокола на следния линк.

Трипановото синьо ще оцвети клетките, които имат компрометирана мембрана. Той не може да направи разлика между компрометирани мембрани, причинени от апоптоза или некроза.

Зависи от вида на флуоресцентното оцветяване, използвано върху клетките. Трипановото синьо е клетъчно непроницаем хромофор, който може да потуши флуоресценцията. Може да потуши флуоресцентното оцветяване на повърхността на живите клетки или вътрешното флуоресцентно оцветяване в мъртвите клетки.

Трипановото синьо ще се свърже със серумните протеини, както и с клетъчните протеини, което може да доведе до високо ниво на фоново оцветяване. Ако фонът е твърде тъмен, клетките трябва да се пелетират и ресуспендират в среда без протеин, буфер или нормален физиологичен разтвор преди преброяването.

Трипаново синьо е клетъчно непроницаемо петно, използвано за оценка на броя на мъртвите клетки в жизнеспособна популация. Неговата полезност се основава на факта, че е заредено багрило и не влиза в клетките, освен ако мембраната не е компрометирана. Живите (жизнеспособни) клетки изключват багрилото, но мъртвите (нежизнеспособни) клетки или клетки с компрометирана мембрана са оцветени в интензивно синьо.

Както Countess™ II, така и Countess™ II FL автоматизираните броячи на клетките включват автофокус, сензорен екран, броене на ярко поле и тест за жизнеспособност с помощта на трипаново синьо и използват слайдове за еднократна употреба. Автоматизираният брояч на клетките Countess™ II FL може също да побере стъклено стъкло за многократна употреба и откриване на флуоресценция с помощта на светлинни кубчета на базата на EVOS™ LED.

Да, инструментът Countess™ II FL използва същите светлинни кубчета като системите за изображения EVOS™. Инструментът Countess™ II не използва светлинни кубчета. Инструментът Countess™ II FL без инсталирани светлинни кубчета ще функционира точно като инструмента Countess™ II — като брояч на клетки със светло поле.

Да, инструментът Countess™ II FL не изисква светлинни кубчета и може да се използва без тях, ако не се изисква флуоресценция.

Не, инструментите Countess™ II и Countess™ II FL не изискват компютър.

Няма наличен компютърен софтуер, тъй като данните не изискват специален софтуер за отваряне. Файловете могат да бъдат записани на USB като стандартни файлове с изображения (JPEG, PNG, TIFF или BMP), които да бъдат отворени от всяка външна програма за изображения, или данните могат да бъдат записани на USB в CSV файл, който да се отваря от програма за електронни таблици. Софтуерът за инструментите може да бъде изтеглен от тук.

Не. Можете да използвате USB устройство за прехвърляне на вашите данни от инструмента към компютър, който използва операционна система Windows™.

Инструментите Countess™ II и Countess™ II FL нямат вътрешна памет, така че няма файлове, които трябва да бъдат изтрити. Файловете могат да бъдат записани на USB като стандартни файлове с изображения (JPEG, PNG, TIFF или BMP), които да бъдат отворени от всяка външна програма за изображения, или данните могат да бъдат записани на USB в CSV файл, който да се отваря от програма за електронни таблици.

USB портовете са идентични, но ако USB или външно устройство е свързано към двата порта едновременно, ще бъде разпознато само първото свързано устройство за съхранение. USB мишка може да се използва и в някой от USB портовете.

Инструментите Countess™ II и Countess™ II FL имат много малък отпечатък (23 cm (w) x 14 cm (d) x 23 cm (h)) и тежат около 3,6 kg (без инсталирани светлинни кубчета). Светлинните кубчета не са включени в инструмента Countess™ II FL, те трябва да бъдат закупени отделно.

Почистете повърхността на инструмента с влажна кърпа. За да почистите LCD екрана, изключете инструмента, извадете захранващия кабел и почистете LCD екрана с мека кърпа, леко навлажнена с почистващ препарат за LCD. Почистването на екрана с прекомерна сила може да повреди LCD екрана. Избършете екрана на сухо незабавно. Инструментите Countess™ II и Countess™ II FL нямат подвижни части за поддръжка, няма тръби за почистване и няма буфери за смяна.

Инструментите Countess™ II и Countess™ II FL идват предварително калибрирани. Не е нужно да калибрирате инструментите.

Не. Инструментът Countess™ II няма електрически компоненти за приемане на светлинни кубчета за откриване на базата на флуоресценция. Може да се използва само за откриване на светло поле.

Не, само инструментът Countess™ II FL ще приеме слайда за многократна употреба. Инструментът Countess™ II може да приема само слайдове за еднократна употреба.

Да, слайдовете имат различна дебелина, така че номиналният фокус трябва да бъде зададен както за слайдовете за многократна употреба, така и за еднократната употреба. Веднъж настроен, инструментът Countess™ II FL може да открие кой слайд се използва и да приложи подходящата номинална стойност на фокуса.

Преброява се зрително поле, 2,2 mm x 1,6 mm, което дава a

3,5 квадратни мм общо. Инструментите Countess™ II и Countess™ II FL отчитат само едно зрително поле, което съответства директно на зрителното поле, видимо на екрана, без да се прилага увеличение.

Понастоящем ние доставяме само пързалки за еднократна употреба индивидуално опаковани.

Не. Софтуерът за изображения на инструментите Countess™ II Countess™ II FL не може да открие подвижни клетки. Клетките трябва да бъдат имобилизирани или фиксирани преди анализа.

1 x 10E5 до 4 x 10E6 клетки/mL е основният диапазон на доверие, който ще даде най-добра точност и прецизност. Извършено е преброяване на проби от 1 x 10E4 до 1 x 10E7 клетки/mL, но с по-голяма вариабилност в броя.

Инструментите Countess™ II и Countess™ II FL могат да откриват частици/клетки в диапазона от 4–60 μm. Точна оценка на жизнеспособността е възможна с клетки, вариращи от 7–60 μm.

Сложен алгоритъм за анализ на изображения идентифицира обекти и класифицира частиците или клетките по закръгленост и размер и след това разграничава живите клетки от мъртвите по техния модел на оцветяване.

Тя се основава на изключване на багрилото с 0,2% трипаново синьо багрило. Живите клетки изключват багрилото. Мъртвите клетки показват интензивно оцветяване на вътреклетъчните протеини.

Не, за съжаление няма достъп до клетката по размер на клетката и флуоресцентните данни, използвани за изготвяне на хистограмата.

Да, пакетът IQ⁄OQ (Квалификация за инсталиране⁄Оперативна квалификация) Извършвани от потребителя тестови процедури може да бъде закупен отделно чрез вашия търговски представител (кат. № A28154). Ако имате нужда от инженер, който да изпълнява IQ⁄OQ протокола, Cat. № е 4479677 за еднократен тест или 4479671 за процедури с повторен тест.

Ние не продаваме анализи, специфични за инструмента Countess™ II FL, но ние утвърдихме някои от нашите съществуващи флуоресцентни анализи за жизнеспособност и апоптоза за инструмента Countess™ II FL. Бележки за приложение за флуоресцентни анализи за жизнеспособност и апоптоза могат да бъдат намерени тук.

Да, броят на жизнеспособността и концентрацията на светло поле отчитат разреждането, така че показаните стойности са за оригиналната клетъчна проба преди разреждането в трипаново синьо.

Не. Приготвянето на пробата с трипаново синьо беше опростено до 1:1 смесване, зареждане, четене и даденият резултат взема предвид само това 2-кратно разреждане. Всички допълнителни разреждания за окончателен отговор трябва да бъдат изчислени от потребителя.

Тествани са следните клетъчни линии и първични клетки:

  • Клетъчни линии: HEK 293, A431, CHO-M1, CHSE, COLO-205, COS-7, HeLa, HepG2, HL-60, J774(MMM), Jurkat, K-562, MCF-7, MRC-5, NIH /3T3, PC-12, SF-21, U266 и U2OS
  • Първични клетки: стволови клетки, получени от човешка мастна тъкан, HASMCs, HPAECs, HPASMCs, HUVECs, C2C12, RBCs и PMBCs

Когато тествахме автоматизираните броячи на клетки Countess™ II и Countess™ II FL успоредно с оригиналния автоматизиран брояч на клетки Countess™, използвайки същите клетки и слайдове, променливостта от броене до броене между инструментите беше <10%.

При броене в режим на светло поле, инструментите Countess™ II и Countess™ II FL автоматично приемат, че е направено разреждане 1:1 с трипаново синьо. Същото предположение не се прави, когато е в режим на флуоресценция.

Когато опитен работник преброява ръчно клетки с помощта на стъклен хемоцитометър заедно с микроскоп, променливостта на броене към броене на една проба обикновено е 10% или повече.

Потребителите на инструментите Countess™ II и Countess™ II FL обикновено трябва да наблюдават <5% вариабилност от броене до броене.

Не, за да се получи информация за жизнеспособността на яркото поле и флуоресценцията, трябва да се извършат две отделни преброявания.

Да, инструментът може да брои както в режим на флуоресценция, така и в режим на ярко поле, което позволява лесно изчисляване на ефективността на трансфекция, която се показва на екрана с резултати като „% положителен“ за светлинния куб, който представлява интерес.

Не, бактериите са твърде малки, за да бъдат разграничени от неклетъчните остатъци.

Да, но може да се наложи да експериментирате с няколко настройки за кръговост, докато намерите тази, която е най-подходяща за вашия тип клетка.

Усъвършенстваните алгоритми за броене на инструментите Countess™ II и Countess™ II FL могат ясно да идентифицират клетъчните граници в рамките на групи клетки, което обикновено води до точен брой клетки.

Да, инструментите Countess™ II и Countess™ II FL могат да броят PBMC. Те обаче не могат да направят разлика между видовете бели кръвни клетки.

Да, инструментите Countess™ II и Countess™ II FL могат да отчитат червените кръвни клетки. Въпреки това препоръчваме кръвната проба да се разрежда приблизително 1:10 000. Инструментът не може да оцени жизнеспособността на червените кръвни клетки поради тяхната пигментация и модел на оцветяване с трипаново синьо.

Инструментите Countess™ II и Countess™ II FL не отчитат живи сперматозоиди или други бързо движещи се клетки като протозои.

Ако има две клетки, прикрепени една към друга с достатъчно кръгова дефиниция за всяка, фърмуерът за анализ на изображения ще ги различи като два различни обекта.

Тествахме над 20 често използвани типа клетки, включително първични клетки, PBMC, клетки на насекоми и рибни клетки, използвайки настройките по подразбиране. Специфични типове клетки може да изискват някои настройки на параметрите, които могат да бъдат оптимизирани от потребителя.

Инструментите Countess™ II и Countess™ II FL са оптимизирани за преброяване на клетки от бозайници, но преброяването на други типове клетки може да е възможно.

Досега не сме открили алтернативни багрила за измерване на жизнеспособността на яркото поле, които могат да се използват с инструментите Countess™ II и Countess™ II FL. Въпреки това, много флуоресцентни петна или протеини могат да бъдат визуализирани на инструмента Countess™ II FL, при условие че е инсталиран правилният светлинен куб.

Инструментът Countess™ II FL може да работи с багрила, които може би вече използвате за измерване на жизнеспособността. Някои популярни багрила, които са били валидирани на инструмента Countess™ II FL, са включени в таблицата по-долу:

Комплект за изображения на жизнеспособността на клетките ReadyProbes™, синьо/зелено

Комплект за изображения на жизнеспособност на клетките ReadyProbes™, син/червен

DAPI RFP или Texas Red™ боя

Комплект за жизнеспособност/цитотоксичност LIVE/DEAD™

Реагент ReadyProbes™ с пропидиев йодид

Оцветяване със зелена нуклеинова киселина SYTOX™

SYTOX™ Red Dead Cell Stain

Инструментът Countess™ II FL може да работи с багрила, които може би вече използвате за измерване на апоптоза. Някои популярни багрила, които са валидирани на инструмента Countess™ II FL, са включени в таблицата по-долу:

CellEvent™ Caspase-3/7 Зелен реагент за откриване

SYTOX™ Red Dead Cell Stain

Зависи от вида на флуоресцентното оцветяване, използвано върху клетките. Трипанова улика е клетъчно непроницаема, цветна боя, която може да потуши флуоресценцията, така че може да потуши флуоресцентното оцветяване на повърхността на живите клетки или вътрешното флуоресцентно оцветяване в мъртвите клетки.

Не, инструментите Countess™ II и Countess™ II FL са снабдени с кутия с пързалки, но не са снабдени с трипанова улика, така че ще трябва да бъдат закупени отделно (кат. № T10282). Ако закупите кутия с диапозитиви отделно, слайдовете ще се доставят с трипаново синьо петно.

Тъй като флуоресценцията се измерва в относителен мащаб, това е твърде зависимо от околната среда, за да предложи количествен отговор. Накратко, инструментът Countess™ II FL предлага флуоресцентна чувствителност, подобна на тази на епифлуоресцентен микроскоп с ниско увеличение.

Трипановото синьо е необходимо за разграничаване на живо/мъртво и осигурява контраст за клетките, но ако не се изисква информация за жизнеспособността, някои клетки може сами да имат достатъчно контраст, за да бъдат преброени в светло поле без трипаново синьо. Стойността на клетъчната концентрация, получена в светло поле, предполага, че клетките са разредени 1:1 в трипаново синьо, така че ако клетките не са разредени, ще трябва да разделите концентрацията на 2, за да получите точна концентрация за клетки, които не са смесени с трипаново синьо .

Оригиналният автоматичен брояч на клетки Countess™ е спрян от производство. Въпреки това, ние все още предлагаме консумативи за инструмента. Най-актуалният софтуер и фърмуер за оригиналния Countess™ Automated Cell Counter все още са достъпни тук в долната част на страницата под „Изтегляне на оригинален софтуер Countess“. Софтуерът се предоставя и на USB устройството, което се доставя безплатно с инструмента. Този софтуер ви позволява да манипулирате данните си за броене на клетки и да запазвате данните си във формат pdf отчет за отпечатване или архивиране.

Забележка: Като алтернатива на оригиналния автоматичен брояч на клетки Countess™, ние предлагаме автоматичните броячи на клетки Countess™ II и Countess™ II FL.


Въведение

Трансфузията на червени кръвни клетки е обичайна практика в съвременната медицинска помощ, с приблизително 90 милиона трансфузирани единици всяка година в целия свят [1]. Черните кръвни клетки очевидно претърпяват метаболитни и структурни промени по време на съхранение на течности, което се нарича лезия на съхранение [2]. Въпреки че връзката с клиничния резултат остава дискутирана, лезията на съхранение може да наруши функцията на червените кръвни клетки и да ускори тяхното краткосрочно и дългосрочно изчистване [3, 4]. Продължителното съхранение може да доведе до бързо отстраняване на до 25-30% от трансфузираните червени кръвни клетки от ретикуло-ендотелната система в рамките на 24 часа, [5] вероятно причинявайки съответно намаляване на очаквания клиничен отговор на реципиента. При мишки бързата медиирана от макрофаги фагоцитоза на съхранените червени кръвни клетки е свързана с дълбока провъзпалителна цитокинова буря поради претоварване с желязо [6, 7]. Досега не са представени ясни доказателства за такъв отговор при хора, с изключение на доклад при недоносени бебета [8]. Механизмът зад тази бърза фагоцитоза, медиирана от макрофаги, не е добре разбран, но вероятно се дължи на комбинация от свързани със съхранението метаболитни и структурни промени в популацията на червените кръвни клетки. Инвитро проучванията наистина са идентифицирали редица зависими от времето промени на съхраняваните в течност червени кръвни клетки, включително намаляване на вътреклетъчния АТФ, повишен оксидативен стрес и изместване на формата на мембраната, което може да намали деформируемостта на мембраната и да увеличи везикулацията, където последното води до натрупване на MPs в носителя за съхранение [9, 10]. In vivo стареенето на червените кръвни клетки споделят няколко характеристики с описаните за лезията на съхранение, включително намалена метаболитна активност, окислително увреждане и загуба на мембрана чрез везикулация [11].

Доказано е, че използването на миши моделна система наподобява няколко от характеристиките на съхраняваните от човека червени кръвни клетки по отношение както на лезията на съхранение, така и на възстановяването след трансфузия [12] и може да предложи възможност за изследване на механистични аспекти, които не са възможни за изследване в хората поради етични съображения. Доказано е, че експериментално окислените червени кръвни клетки могат да бъдат фагоцитирани от макрофагите по серумно-зависим начин и че такова поглъщане може да бъде инхибирано чрез блокиране на SR-A [13]. Това повдига въпроса дали този механизъм на поглъщане може да бъде от значение и за съхраняваните червени кръвни клетки, тъй като оксидативният стрес е една от характеристиките на лезията на съхранение [10].

Следователно целите на настоящото изследване бяха да се характеризира модел на съхранение на миши RBC, който трябва да наподобява този за съхранявани човешки червени кръвни клетки, и да се изследва възможността SR-A да участва в разпознаването на макрофагите на съхранените червени кръвни клетки.


Зони за броене на клетки в камерата на Нойбауер

Преброяването може да се извърши или в централния голям квадрат, или в ъгловите квадрати, в зависимост от размера на изследваните клетки.

Зона за броене на WBC
Четирите големи квадрата, поставени в ъглите, се използват за броя на белите кръвни клетки. Тъй като тяхната концентрация е по-ниска от червените кръвни клетки, е необходима по-голяма площ за извършване на броя на клетките.

Зона за броене на RBC
Големият централен квадрат се използва за броя на червените кръвни клетки. Както вече беше посочено, тази зона е разделена на 25 средни квадрата, които от своя страна са разделени на 16 квадрата.

От 25-те средни квадрата само четирите ъглови квадрата и централният квадрат в големия централен квадрат се използват за преброяване на RBC.

Зона за броене на тромбоцити
Големият централен квадрат се използва за броене на тромбоцити. Броят се тромбоцитите във всичките 25 квадрата в големия централен квадрат.


Приложения за хемоцитометър

Оценете размера на клетката

Тъй като решетката има специфичен размер, някои линии са 0,25 mm между някои линии са 0,05 mm между тях (вижте изображението по-долу). Следователно можете лесно да оцените размера на клетките. Ако искате да определите по-точно размера на клетката, можете да направите снимка на изображението под микроскоп. След това използвайте софтуер като изображение J, където можете да кажете на софтуера „фиксирана дължина е равна на 1 mm“. Той ще преобразува и изчисли размера на клетката за вас.

Извършете броя на кръвните клетки

Първоначално хемоцитометърът е проектиран за кръвна картина. Нашата кръв се състои от червени кръвни клетки, бели кръвни клетки и тромбоцити. Номерът на клетката и съставът на всеки тип клетки могат да кажат на лекаря за здравословното ви състояние на тялото. Например, ниският брой на червените кръвни клетки причинява чувство на умора и слабост (анемия). Увеличаването на броя на белите кръвни клетки може да показва инфекция, алергия, възпаление или други заболявания. Следователно, хемоцитометърът е много важен инструмент в лабораторията за медицински тестове поради способността му да брои броя на клетките и състава на всеки тип клетки.

Извършете клетъчно броене за клетъчна култура

Когато отглеждам клетки в лабораторията, трябва да сменям клетъчната среда на всеки няколко дни (в зависимост от това колко бързо растат клетките). След като прилепналите клетки нараснат, за да заемат 95% от повърхността на чиния, е време за „преминаване“ на клетките към друга чиния. Това, което правим, е да отделим клетките, да направим хомогенна суспензия и да преброим броя на клетките. Броят на клетките е много важен за клетъчната култура. Клетките може да не растат много добре или да умрат, ако имате твърде малко клетки в чиния. Следователно, способността да се брои броят на клетките е основно умение за клетъчната култура.


Костен мозък

Това обикновено се изолира от дългите кости – бедрена кост (заден крак) и раменна кост (преден крак).

Обелете кожата на гърба, за да откриете дългите кости

С помощта на чифт извити ножици отрежете по-голямата част от мускула от костта

Придържайки съседната кост (тибия или радиус) с форцепс, рефлексирайте ставата (коляно или лакът) и разрежете горната и долната става, за да отстраните необходимата кост.

Поставете костта в стерилен PBS в паничка на Петри за съхранение, докато не бъдат събрани всички необходими кости

Костният мозък се извлича от костите чрез промиване с помощта на спринцовка и игла. Най-добре е да използвате спринцовка, която ще задържи общия обем на костния мозък, генериран по време на промиване, за етапа на аспирация в края на подготовката на всички етапи, избягвайте образуването на пяна

Напълнете спринцовка от 2 ml с PBS и прикрепете 25 g (оранжева игла)

Дръжте костта с форцепс, използвайте ножица, за да отстраните епифизите (краищата) от костта

Вкарайте иглата в единия край на костта и я прокарайте в универсална епруветка с PBS

Повторете процедурата през другия край на костта

В този момент екстрахираният костен мозък ще бъде смес от единични клетки, бучки и ‘епруветки’, за да се получи суспензия от единична клетка, извлеченият костен мозък трябва да бъде аспириран през серия от игли с нарастващ размер.

Изтеглете през игла 19g (бяла)

Изхвърлете през игла 21g (зелена)

Изтеглете през игла 23g (синя)

Изхвърлете през игла 21g (оранжева)

Единичната клетъчна суспензия е приготвена

Направете клетки до 25 ml в PBS

Центрофугирайте при 400 g за 5 минути (около 1600 об/мин в настолна центрофуга)

Разхлабете пелетата, като разклатите основата на тръбата

Пребройте клетките –, тъй като костният мозък е богат на червени кръвни клетки и броят на белите клетки трябва да се преброи, най-добре е аликвотната част за преброяване да се разреди в течност за броене на бели кръвни клетки (WCF 3% оцетна киселина в дестилирана вода плюс връх @knife от тинтява или кристално виолетово). Обикновено 10 ul в 40 ul WCF дава разумен брой на хемоцитометър. Преброяването трябва да се извърши възможно най-скоро след разреждането, тъй като червените кръвни клетки се унищожават незабавно, в крайна сметка и белите кръвни клетки също ще бъдат унищожени.

Ресуспендирайте клетките при 5 x 10 7 /ml в PBS за инжектиране. За оцветяване на клетки за поточна цитометрия клетките трябва да бъдат ресуспендирани при 1 х 10 7 /ml във FACS-PBS.

Далак

След обелване на кожата за отстраняване на костния мозък и събиране на PEC

С помощта на форцепс вземете перитонеалната мембрана близо до средната линия точно под гръдната кост и направете разрез. След това изрежете под диафрагмата и след това надолу към опашката, за да позволите на перитонеалната мембрана да бъде изтеглена назад, за да се разкрие коремното съдържание. Далакът е от лявата страна на мишката, пъхнат под черния дроб.

Хванете края на далака и го повдигнете нагоре, след което освободете далака от мазнините и съединителната тъкан с помощта на ножица. Съхранявайте далака в PBS, докато сте готови за приготвяне на суспензия на единични клетки.

Преди обработка не забравяйте да претеглите далака.

Има редица начини за приготвяне на едноклетъчна суспензия от далак, най-бързият и най-простият, като се използва 5 ml насипен стъклен хомогенизатор.

Използвайте форцепс, за да прехвърлите далака в хомогенизатор

Поставете стъклената пръчка в хомогенизатора, упражнете лека сила надолу и завъртете пръчката 3 пъти – това трябва да е достатъчно, за да освободите пулпата от капсулата на далака

Добавете 4 ml PBS към хомогенизатора и разбъркайте чрез лека аспирация, като избягвате образуването на пяна

Отломките и бучките могат да бъдат отстранени, като се остави клетъчната суспензия да престои 2-3 минути и се декантират суспендираните клетки в нова епруветка чрез пипетиране или чрез прекарване на клетъчната суспензия през найлонова мрежа.

Направете клетки до 25 ml в PBS

Центрофугирайте при 400 g за 5 минути (около 1600 об/мин в настолна центрофуга)

Разхлабете пелетата, като разклатите основата на тръбата

Пребройте клетките – тъй като далакът е богат на червени кръвни клетки и броят на белите клетки трябва да се преброи, най-добре е аликвотната част за преброяване да се разреди в течност за преброяване на белите кръвни клетки (WCF 3% оцетна киселина в дестилирана вода плюс @ връх на нож от тинтява или кристално виолетово). Обикновено 10 ul в 40 ul WCF дава разумен брой на хемоцитометър. Преброяването трябва да се извърши възможно най-скоро след разреждането, тъй като червените кръвни клетки се унищожават незабавно, в крайна сметка и белите кръвни клетки също ще бъдат унищожени.

За оцветяване на клетки за поточна цитометрия клетките трябва да бъдат ресуспендирани при 1 x 10 7 /ml във FACS-PBS.

Тимус

След обелване на кожата

Използвайте форцепс, за да хванете мечовидната гръдна кост и използвайте ножици, изрязани по протежение на и над диафрагмата, за да влезете в гръдния кош

Използвайте ножици, за да отрежете от двете страни на гръдния кош

Хванете мечовидната гръдна кост с форцепс и повдигнете нагоре и рефлексирайте над главата

Тимусът покрива сърцето

Използвайте форцепс, за да освободите тимуса от сърцето

След това използвайте чифт извити форцепси, за да хванете тимуса в неговия произход и използвайте втора чифт форцепс, поставен точно под първата двойка, за да отделите тъканта

Съхранявайте в PBS до готовност за приготвяне на суспензия от единични клетки.

Използвайте форцепс, за да прехвърлите тимуса в хомогенизатор

Поставете стъклената пръчка в хомогенизатора, упражнете лека сила надолу и завъртете пръчката 3 пъти – това трябва да е достатъчно, за да освободи клетките от капсулата

Добавете 4 ml PBS към хомогенизатора и разбъркайте чрез лека аспирация, като избягвате образуването на пяна

Отломките и бучките могат да бъдат отстранени, като се остави клетъчната суспензия да престои 2-3 минути и се декантират суспендираните клетки в нова епруветка чрез пипетиране или чрез прекарване на клетъчната суспензия през найлонова мрежа.

Направете клетки до 25 ml в PBS

Центрофугирайте при 400 g за 5 минути (около 1600 об/мин в настолна центрофуга)

Разхлабете пелетата, като разклатите основата на тръбата

Пребройте клетките –освен ако не е имало кървене в гръдния кош, няма нужда да използвате WCF, клетките могат да се преброят без разреждане

За оцветяване на клетки за поточна цитометрия клетките трябва да бъдат ресуспендирани при 1 x 10 7 /ml във FACS-PBS.


Опции за достъп

Получете пълен достъп до дневника за 1 година

Всички цени са НЕТНИ цени.
ДДС ще бъде добавен по-късно при плащането.
Изчисляването на данъка ще бъде финализирано по време на плащането.

Получете ограничен във времето или пълен достъп до статия в ReadCube.

Всички цени са НЕТНИ цени.


Протокол за поточна цитометрия за маркери за клетъчна повърхност

Имунофенотипирането на суспендирани клетки на базата на антигени, присъстващи на клетъчната повърхност, е едно от най-честите приложения на поточната цитометрия. Тъй като протеините на клетъчната повърхност са лесно достъпни за антитялото, не е необходима стъпка на пермеабилизация. Чрез оцветяване на маркери на клетъчната повърхност изследователите могат да идентифицират специфични клетъчни популации и да извършват флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS).

Следният протокол за оцветяване с поточна цитометрия е разработен и оптимизиран от R&D Systems Flow Cytometry Laboratory. Този протокол е предназначен за оцветяване на протеини на клетъчната повърхност. Препоръчва се експерименталните условия, като концентрация на антитяло, време на инкубация и температура, да бъдат оптимизирани за всеки експеримент с поточна цитометрия.

Моля, прочетете следния протокол за оцветяване с поточна цитометрия в неговата цялост, преди да започнете.

Съдържание

Видео протокол за поточна цитометрия

Необходими реагенти

  • Блокиращи Fc рецептори реагенти (Те включват Fc рецептор блокиращи антитела или IgG разтвори) или Flow Cytometry Mouse Lyse Buffer (10X Catalog # FC003) или еквивалентен или еквивалентен разтвор, съдържащ BSA и натриев азид, подходящ за използване в поточна цитометрия

Необходими материали

  • Епруветки FACS™ (5 mL полистиролови епруветки с кръгло дъно)
  • Накрайници за пипети и пипети
  • Центрофуга
  • Вихър

Приготвяне на пробата:

За оцветяване на периферни кръвни клетки, цялата кръв трябва да се събира в евакуирани епруветки, съдържащи EDTA или хепарин като антикоагулант. Замърсяващите серумни компоненти трябва да се отстранят чрез промиване на клетките три пъти в изотоничен фосфатен буфер (допълнен с 0,5% BSA) чрез центрофугиране при 1250-1500 rpm/350-500 x g за 5 минути.

За оцветяване на клетъчни линии или клетки от активирани клетъчни култури, клетките трябва да се центрофугират при 1250-1500 rpm/350-500 xg в продължение на 5 минути и да се промиват три пъти в изотоничен PBS буфер (допълнен с 0,5% BSA), за да се отстрани остатъчният растеж фактори, които могат да присъстват в хранителната среда.

Прилепналите клетъчни линии може да изискват предварителна обработка с 0,5 mM EDTA, за да се улесни отстраняването от техните субстрати. Клетките, които изискват трипсинизация, за да се даде възможност за отстраняване от техните субстрати, трябва допълнително да се инкубират в среда за 6-10 часа върху платформа за люлеене, за да се даде възможност за регенерация на рецепторите. Използването на платформата за люлеене ще предотврати повторното закрепване към основата.

Процедура

  1. Събирайте клетки и аликвотни части до 1 x 10 6 клетки/100 μL в епруветки FACS. Fc-блок клетки с блокиращ IgG (1 μg IgG/10 6 клетки) за 15 минути при стайна температура.
    Забележка: Не отмивайте излишния блокиращ IgG от тази реакция.
  2. Добавете конюгирано първично антитяло (5-10 μL/10 6 клетки или предварително титрирано количество) и разбъркайте на вортекс. Инкубирайте клетките за 30 минути при стайна температура на тъмно.
  3. Отстранете всяко несвързано антитяло чрез промиване на клетките в 2 mL оцветяващ буфер за проточна цитометрия (каталожен номер FC001). Центрофугирайте суспендираните клетки при 1250-1500 rpm/350-300 x g за 5 минути и декантирайте буфера. Ресуспендирайте клетките, като добавите 2 mL буфер за оцветяване с проточна цитометрия. Повторете тази стъпка на измиване два пъти.
    Забележка: Ако използвате цяла кръв, пробите трябва да преминат през стъпка за лизиране на червените кръвни клетки в този момент. За да лизирате червените кръвни клетки, добавете 2 mL 1X Flow Cytometry Human Lyse Buffer (каталожен номер FC002) или 1X Flow Cytometry Mouse Lyse Buffer (каталожен номер FC003) към всяка епруветка. Разбъркайте и инкубирайте на тъмно при стайна температура за 10 минути. Центрофугирайте и промийте клетките в буфер за оцветяване с проточна цитометрия, както е описано в стъпка 3 по-горе.
    Забележка: Ако се използва неконюгирано първично антитяло, сега трябва да се извърши инкубация с подходящо вторично антитяло. Разредете вторичното антитяло в буфер за оцветяване с проточна цитометрия (каталожен номер FC001), като се започне с предложената концентрация в листа с данни за продукта. Инкубирайте за 20-30 минути на тъмно и измийте, както е описано в стъпка 3.
  4. Ресуспендирайте клетките в 200 – 400 μL буфер за оцветяване с проточна цитометрия (каталожен номер FC001) за окончателен проточен цитометричен анализ.

Препоръчително е да се проведе отрицателна контрола. Отделен набор от клетки трябва да бъде оцветен с изотипно контролно антитяло, като се използват стъпките, описани по-горе.


Методи

Подготовка на проба от мишка Бм-Инфекция на червените кръвни клетки и определяне на паразитемия

Протоколът за грижа и употреба на животните се придържа към Корейския закон за лабораторните животни (Закон № 902 и 93). Всички експериментални протоколи бяха одобрени от Комитета по етика на експериментите с животни на Корейските центрове за контрол и превенция на заболяванията (номер на разрешение KCDC-035-13-2A). Използването на опитни животни се поддържа и обработва в стриктно съответствие с институционалните указания на Комитета по етика на експериментите с животни на Корейските центрове за контрол и превенция на заболяванията. Процедурата на B. microti инфекцията при мишки е спазена с институционалните насоки и разпоредби, като се полагат максимални усилия да се сведе до минимум броят на използваните животни. B. microti, щам: Peabody mjr (ATCC PRA-99, САЩ) се поддържа в Balb/c мишки (KOATECH, Gyeonggi-do, Корея) преди инфекцията за това проучване. За преминаване на напрежението, B. microti заразената кръв се отстранява от заразената мишка с помощта на сърдечна пункция с помощта на спринцовка и се прехвърля бързо в EDTA епруветка. За инфекцията, 100 μL заразена кръв (20

30% паразитемия) суспензия се инжектира интраперитонеално в Balb/c мишки. Контролните мишки се инжектират с равен общ брой неинфектирани клетки. Общо три здрави мишки като контрола и три B. microti са използвани заразени мишки. Паразитомия след B. microti инфекцията се идентифицира чрез микроскопска визуализация на тънки кръвни намазки от кръв от опашката, оцветена с 5% разтвор на Giemsa (Merck, Darmstadt, Germany). Процентът на паразитемия се определя чрез преброяване на броя на заразените червени кръвни клетки (RBC) спрямо общия брой червени кръвни клетки: % паразитемия = (инфектирани червени кръвни клетки / общи червени кръвни клетки) × 100. Бяха преброени минимум 500 червени кръвни клетки и един RBC, заразен с множество паразити се отчитат като една инфектирана клетка. За оптично измерване, управление и B. microti заразената кръв се разрежда 300 пъти в DPBS буфер. В допълнение, CBC кръвен тест за здрава и инфектирана кръв беше извършен с помощта на автоматизиран хематологичен анализатор (MEK-6450, NIHON JOHDEN, Япония). MCV, MCHC и MCH бяха използвани сред параметрите от резултатите от CBC.

Дифракционна дифракция по общ път Оптична томография (cDOT)

За 3-D RI томография, оптичното поле се измерва на базата на лазерно-интерферометрична микроскопия с общ път и оптична дифракционна томография 13 . Накратко, лазерен лъч от диодно изпомпван твърдотелен (DPSS) лазер (λ = 532 nm, 50 mW, Cobolt, Solna, Швеция) беше осветен с различни ъгли на осветяване към пробата. Пробата, разредена кръв, притисната между две капаци glasses, is placed between the condenser lens [UPLSAPO 60×, numerical aperture (NA) = 0.9, Olympus, Japan] and objective lens (UPLSAPO 60×, NA = 1.42, Olympus, Japan). The angle of incident beam was controlled by rotating a two-axis galvanometer mirror (GM1) (GVS012/M, Thorlabs, USA). The diffracted beam from a sample was also passing through second galvanometer (GM2), which was located at the conjugated plane of sample and synchronized with GM1 that the reflected beams have same optical path regardless of illumination angle. After GM2, the diffraction phase microscopy based on common-path interferometry was used to collect the diffraction beam from sample. Using a diffraction grating (70 grooves mm −1 , #46-067, Edmund Optics Inc., NJ, USA), the 1 st order beam as a sample beam was interfered with spatially filtered 0 th order beam that serves as a reference. Then, this spatially modulated interferograms were recorded on high-speed sCMOS camera (Neo sCMOS, ANDOR Inc., Northern Ireland, UK) having 528 × 512 resolution with a frame rate of 125 Hz while the incident beam was scanning spirally with 600 different angles. The total magnification of cDOT was 240 by an additional 4-е система. From measured hologram images, 3-D RI distribution of sample was reconstructed via optical diffraction tomography algorithm, found elsewhere 15 . For the measurements of 2-D height profile and membrane fluctuation dynamics, the fixed normal incident angle was used to generate a hologram and it was recorded by the camera with a frame rate of 125 Hz for 2 sec. Alternately, quantitative phase imaging unit can also be used 44,45 an existing optical microscope can be converted into a 3-D holographic microscope to investigate Bm-RBCs.

Analysis of the red cell indices

The six of red cell indices are comprised of morphological (surface area, volume and sphericity), chemical (Hb concentration and content) and mechanical (membrane fluctuation) parameters.

To measure the morphological parameters, we used the reconstructed 3-D RI maps by the diffraction optical tomography algorithm from measured multiple optical phase maps corresponding to various illumination angles on the sample. The whole volume of host Bm-RBCs were calculated by integrating all voxels inside individual Bm-RBCs. The space corresponding to cytoplasm of a RBC was selected by RI with a higher value than threshold. The threshold was defined by 50% of RI difference between the maximum RI of the cell нcell_max and surrounding medium нм for determine the cell boundary, i.e. нthresh = нм + 0.5 (нcell_maxнм). За Bm-RBCs with apparent PVs, voxels of inclusion PVs inside cytoplasm were also counted. Then, the total number of voxels was multiplied by the magnification of the optical system to translate in a length scale. Next, for surface area measurements, the isosurfaces of individual RBCs were reconstructed from volume data of 3-D RI maps using MATLAB. Surface area of isosurface is measured through the sum of the areas of all the patch faces, which are broken down into small triangular pieces. In addition, the sphericity index SI, a dimensionless quantity ranging from 0 to 1, was obtained by calculating SI = π 1/3 (6V) 2 / 3 /А където V is the volume and А is the surface area 14,46,47 .

For measurement of the cellular dry mass, the measured 2-D phase at the normal angle was used. The total dry mass of a RBC was obtained from the integrating 2-D optical phase over entire cell area with RI increment of proteins 47 ,

където СМ is the cellular dry mass, λ is the wavelength of laser light (532 nm), α is RI increment (0.2 mL/g) 24,25,26 and Δφ(x,y) is 2-D optical phase. In addition, the total mass concentration in a RBC was obtained from the total dry mass divided by the cellular volume. The total dry mass quantifies all non-aqueous materials in RBC cytoplasm including Hb and non-Hb proteins.

To measure the mechanical parameter, we calculated the dynamic membrane fluctuation from the successively measured the instantaneous height map з(x,yt), given as:

The values for the membrane fluctuation were calculated by averaging the root-mean-square of height displacement over the cell area and given as:

където зм is the time averaged height at the cell surface.

Light measurement assay for ATP amount in RBCs

30% parasitemia of B. microti infected blood and non-infected blood was collected from Balb/c mouse. RBCs were isolated using Histopaque-1077 from 200 μL blood (Sigma-aldrich, Saint Louis, USA). Briefly, anti-coagulated blood is layered onto Histopaque-1077 and centrifuge at 400 ж for precisely 30 minutes at room temperature. During centrifugation, erythrocytes are aggregated by polysucrose and speedily sediment. Each RBCs were counted to 8 × 10 6 cells/mL and sonicated shortly. All samples were measured using ATP bioluminescent somatic cell assay kit (Sigma-aldrich, Saint Louis, USA). 100 μL of ATP Assay Mix Working Solution was added to a reaction vial at room temperature for 3 minutes. During this period any endogenous ATP will be hydrolyzed. To a separate vial containing 100 μL of 1× Somatic Cell ATP Releasing Reagent, 50 μL of ultrapure water was added and then 50 μL of the cell sample to be assayed was added and immediately measure the light to be emitted азС. The amount of ATP released was determined by following. Both 50 μL of an appropriate ATP Standard (0.5–10 × 10 −10 mole) and 50 μL of the cell sample to be assayed азS&I were added to a 100 μL of 1× Somatic Cell ATP Releasing Reagent. For light measurement, only 100 μL samples were transferred to the reaction vial and instantly measured the amount of light emitted with a luminometer (MicroLumat Plus LB 96V, Berthold technologies, USA). The amount of ATP released was determined by running an internal standard. The ATP concentration in each sample was calculated according to the following formula: where нС and are the number of ATP in the cell sample and a sample with an internal standard (in moles), respectively.


Using a Hemacytometer to Count Cells

Many biomedical experiments require manipulation of a known quantity of cells, in order to achieve accurate, reproducible, and statistically-relevant data. Therefore, learning how to count cells is a particularly essential technique for any successful biomedical scientist. The most common way to count cells is by using a hemacytometer - an instrument that bears two laser-etched grids, which aid in the enumeration of an aliquot cells under a simple light microscope. This data can then be used to extrapolate the number of cells in experimental sample.

This video will show how to: adjust the experimental sample concentration so that you are not trying to count too many – or too few – cells how to use a hemacytometer to count a small (

10 μl) aliquot of cells how to determine which quadrant of the hemacytometer laser grid to use for counting how to calculate the total number of cells in your experimental sample, depending upon which quadrant was used and how to determine the viability of your experimental cell population using trypan blue exclusion. Further, various experimental situations for which reliable and accurate determination of cell numbers is necessary, including an example using an automated cell counter, are also discussed.

Процедура

Cell counting is an important step in many cell-based assays for determining cell number and viability. In general, the goal of counting is to understand how much a sample of an unknown cell concentration should be diluted for further use. The most common laboratory tool for counting cells is the hemacytometer.

The hemacytometer is a counting tool that was originally created for counting blood cells. At the center of the hemacytometer are two counting chambers, upon which a laser etched grid can be found.

The grid is made up of 9 major quadrants. The four corner quadrants are further divided into 16 smaller quadrants. The central quadrant is divided into 25 of these smaller quadrants, each of which is yet further divided into 16 micro-quadrants.

At the far end of each chamber are sample introduction ports, into which the cell sample to be counted is dispensed.

On either side of the counting chambers are the cover slip mounting supports, upon which the quartz coverslip rests, usually about 0.1 mm above the counting chamber.

Since the area of each large square is 1 mm2, the volume contained by each large square is 0.1 mm3 or 1/10,000th of a ml.

Before counting, always take a moment to use ethanol and a kimwipe to clean and dry away any lint, fingerprints, or watermarks from the coverslip and the counting chamber.

Then carefully add a small amount of water to each of the coverslip mounting supports, the surface tension of the water will hold the coverslip in place.

Now gently triturate the cell suspension, or pipette it up and down, to dislodge any cell clumps. Use a micropipette to aspirate about 10 μl of the suspension and then load one of the introduction ports with the sample. The solution will be drawn into the counting chamber by capillary action and should cover the entire grid.

While the cells are settling, select the objective. Then load the hemacytometer onto the stage.

Next view the cells under the microscope. If there are fewer than 5 cells in each of the large quadrants, you may need to spin your sample down again and resuspend the pellet in a smaller volume. If the cells are overlapping each other or are simply too dense to easily distinguish from one another, you may need to dilute your sample in a higher volume of solution. Be sure to keep track of the factor with which you are diluting your cells. You will need it in a later calculation.

Now it&rsquos time to count the cells!

As we talked about earlier, the counting chamber is covered in a laser-etched grid. The lines of the quadrants make it easier to keep track of the cells you are counting. Choose the size quadrant for counting depending on the density of the cells in your sample. For example, if there are a low number of cells, count all the cells in one of the corner quadrants. For samples with a medium amount of cells, choose one of the 16 smaller quadrants. If there is a very high density of cells, count the cells in one of the 25 central quadrants. No matter which quadrant you choose or the density of the cell sample, count at least 20-50 cells per quandrant.

Not all of the cells will fall neatly within the quadrants. You can count the cells that touch the top and left lines, but disregard the ones touching the bottom or right ones. To get the most accurate count, use a cell counter to keep track of the cells and take the average of the number of cells in 4 quadrants of the same size.

To calculate the number of cells in a 1 ml volume, multiply the number of cells counted by 10,000, because, as we mentioned before, each large square on the grid is 1/10,000th of a ml. If you counted one of these larger quadrants, simply multiply this number 1. If you counted one of the smaller squares in one of the corner quadrants, multiply this number by 16. If you counted all of the cells in one of the 25 central quadrants, multiply this number by 25. If you happened to dilute your cell suspension before loading the hemacyotmeter, you will also need to multiply by the dilution factor.

Then, to calculate the number of cells in 1 ml of this sample, we would multiply the 20 cells in this central quadrant by 104 and 25 to get a total of 5 x 106 cells in 1 ml of the sample.

Now that we know the total number of cells in 1 ml of the sample, we need to multiply this number by the total volume of our solution. So for example, if we have 5 x 106 cells in 1 ml, then in 2 ml, we will have a total of 1 x 107 cells.

Then, to avoid errors from miscounting, uneven distribution of cells, or pipetting errors, load the other side of the chamber and count your cell sample a second time.

Counting the cells under the microscope is also a great time to evaluate the viability of the cells in your sample. Trypan blue, a vital stain, is often mixed with the sample prior to being loaded into the hemacytometer for this purpose.

Live cells exclude this dye, because living cells are very selective about what they allow through their membranes. A dead cell, however, does not have an intact membrane, which allows the trypan blue to pass through and stain the cytoplasm.

To check the viability of your cell sample, dilute an aliquot of your cell suspension in trypan blue, and then load the trypan blue stained sample just like the regular cell sample. Under the phase contrast, the live cells will appear bright and golden and should be counted do not count any of the dull, dead, blue cells.

Calculate the number of cells as before, this time multiplying the final number by the trypan blue dilution factor. So if our original representative sample had first been diluted in trypan blue, we then would have multiplied our total number of cells by our 1:10 trypan blue dilution, for a total of 1x108 cells in our sample.

When you&rsquore finished counting, remember to clean the coverslip and counting chamber!

Now that you are a cell counting pro, let’s talk about some of the reasons you might need to know how many cells you have in a particular experiment.

After isolating cells from a normal or experimental tissue, it&rsquos important to know how many cells you’ve recovered. Here the investigators will want to know how many splenocytes, or spleen cells, they have isolated from this mouse spleen.

When you are performing an experiment to see how two different cell populations react, it&rsquos important to know how many of each cell type you are mixing together, like in this co-culture experiment with B and T cells.

You will want to know how many cells you have for many other types of cell-based assays. Here an ELISPOT assay is being set up to determine the number of cells in a sample that will secrete IFNγ, an inflammatory protein, in response to the human papilloma virus.

When performing an experiment in which mRNA needs to be extracted, or isolated, from your cells of interest, it&rsquos important to know how many calls you&rsquore starting with, in order to acquire a sufficient amount of mRNA for the experiment.

The hemacytometer is an inexpensive and relatively easy to use tool for counting cells, but it can be tedious and has the potential for human error.

The Scepter Handheld Automatic Counter is, as the name implies, a hand held counting device that has an improved counting accuracy compared to the hemacytometer and that can discriminate both the size and volume of the cells in a cell sample.

The TC10 automated cell counter evaluates both cell number and viability, automatically calculates the total cell number in your sample, and allows the cells to be viewed on its readout screen as well.

You&rsquove just watched JoVE&rsquos introduction to cell counting. In this video we reviewed: what a hemacytometer is, how to count cells and determine cell viability, and some different reasons you may need to count cells. Thanks for watching and remember not to count the blue cells!


Гледай видеото: Берковица - Черепишки манастир - Казанлък 25 (Може 2022).