Информация

17.2A: Промишлено производство на антибиотици - Биология

17.2A: Промишлено производство на антибиотици - Биология



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Индустриално произведените антибиотици се произвеждат чрез ферментация, при която изходният микроорганизъм се отглежда в голяма течна среда за растеж.

Цели на обучението

  • Опишете как се произвеждат антибиотици в промишлеността чрез ферментация

Ключови точки

  • Антибиотиците са вторични метаболити на микроорганизмите.
  • По време на обработката антибиотикът трябва да бъде извлечен и пречистен до кристален продукт.
  • Полезните антибиотици често се откриват чрез скрининг или рационален процес на проектиране.

Ключови условия

  • антибиотик: Всяко вещество, което може да унищожи или инхибира растежа на бактерии и подобни микроорганизми.
  • ферментация: Всяка от многото анаеробни биохимични реакции, при които ензим (или няколко ензима, произведени от микроорганизъм) катализира превръщането на едно вещество в друго; особено превръщането (с помощта на дрожди) на захарите в алкохол или оцетна киселина с отделяне на въглероден диоксид.
  • метаболит: Всяко вещество, произведено от или участващо в метаболитна реакция.

Антибиотиците се произвеждат индустриално чрез процес на ферментация, при който изходният микроорганизъм се отглежда в големи контейнери (100 000 – 150 000 литра или повече), съдържащи течна среда за растеж.

Концентрацията на кислород, температурата, pH и нивата на хранителните вещества трябва да бъдат оптимални и да се следят внимателно и да се коригират, ако е необходимо. Тъй като антибиотиците са вторични метаболити, размерът на популацията трябва да се контролира много внимателно, за да се гарантира, че се получи максимален добив, преди клетките да умрат. След като процесът приключи, антибиотикът трябва да бъде извлечен и пречистен до кристален продукт. Това е по-лесно за постигане, ако антибиотикът е разтворим в органичен разтворител. В противен случай първо трябва да се отстрани чрез йонен обмен, адсорбция или химическо утаяване.

Микроорганизмите, използвани при ферментацията, рядко са идентични с техните събратя в дивата природа. Това е така, защото видовете често са генетично модифицирани, за да дадат максимални количества антибиотици. Мутацията често се използва и се насърчава чрез въвеждане на мутагени като ултравиолетова радиация, рентгенови лъчи или определени химикали. Изборът и по-нататъшното размножаване на по-високопродуктивните щамове в продължение на много поколения може да повиши добивите с 20 или повече пъти. Друга техника, използвана за увеличаване на добивите, е генната амплификация, при която копия на гени, кодиращи ензими, участващи в производството на антибиотици, могат да бъдат вмъкнати обратно в клетката чрез вектори като плазмиди. Този процес трябва да бъде тясно свързан с повторното тестване на производството и ефективността на антибиотиците.

Въпреки голямото разнообразие от известни антибиотици, по-малко от 1% от антимикробните средства имат медицинска или търговска стойност. Например, докато пеницилинът има висок терапевтичен индекс, тъй като обикновено не засяга човешките клетки, това не е така за много антибиотици. Други антибиотици просто нямат предимство пред тези, които вече се използват или нямат други практически приложения.

Полезните антибиотици често се откриват чрез скрининг процес. За провеждане на такъв скрининг се култивират изолати на много различни микроорганизми и след това се тестват за производство на дифузионни продукти, които инхибират растежа на тестовите организми. Повечето антибиотици, идентифицирани в такъв скрининг, вече са известни и следователно трябва да се пренебрегват. Останалите трябва да бъдат тествани за тяхната селективна токсичност и терапевтични дейности, а най-добрите кандидати могат да бъдат изследвани и евентуално модифицирани.

По-модерна версия на този подход е рационална програма за проектиране. Това включва скрининг, насочен към намиране на нови естествени продукти, които инхибират специфична цел, като ензим, открит само в целевия патоген, а не тестове, които показват общо инхибиране на култура.


Бъдещето на промишленото производство на антибиотици: от случайна мутагенеза до синтетична биология

Естествените продукти, получени от вторичния метаболизъм на микробите, представляват крайъгълен камък на съвременната медицина. Инженерните грешки за производството на тези продукти в големи количества са основно предизвикателство за биотехнологията, която обикновено се решава чрез една от двете стратегии: итеративна случайна мутагенеза или рационален дизайн. Наскоро анализирахме транскриптома на щам Streptomyces clavuligerus, оптимизиран за производство на β-лактамазен инхибитор клавуланова киселина чрез множество кръгове на мутагенеза и селекция, и открихме, че наблюдаваните промени съвпадат изненадващо добре с прости промени, които са въведени в тези щамове от рационално инженерство. Тук обсъждаме как в новата област на синтетичната биология случайната мутагенеза и рационалното инженерство могат да бъдат приложени взаимно допълващо се по начини, които могат да позволят да се премине отвъд статуквото, което сега е достигнато от всеки метод независимо.


Производство на специализирани метаболити от Streptomyces coelicolor A3(2)

Geertje van Keulen, Paul J. Dyson, в Advances in Applied Microbiology, 2014

7 Експлоатация С. coelicolor като общ домакин за производство на антибиотици

С обширните основни познания за производството на антибиотици от С. coelicolor, това е атрактивно "шаси" за експресиране на хетероложни специализирани метаболитни генни клъстери. С оглед на това, щамовете са разработени специално за тази цел (Gomez-Escribano & Bibb, 2011). Един проблем, с който трябва да се борим, е, че съществуващите ендогенни пътища могат да се конкурират с въведените пътища за прекурсорните съединения, доставяни от първичния метаболизъм. За да се преодолее това и по този начин да се оптимизират добивите от хетероложен път, щам без SCP1 (и следователно мами и mmf генен клъстер) е манипулиран за изтриване на хромозомата действай, червен, cda, и cpk клъстери. Изтриването на тези пътища също улеснява идентифицирането на нов продукт, ако той все още се произвежда с нисък добив, тъй като щамът има много опростен извънклетъчен метаболом. В допълнение, насърчаване на производството на антибиотици rpoB (РНК полимераза) и rpsL (рибозомен протеин S12) са въведени мутации. Тези щамове поддържат високи нива на производство на широк спектър от специализирани метаболити от хетероложна експресия на въведени биосинтетични генни клъстери, включително Act (въведен отново), хлорамфеникол (генен клъстер от С. venezualae Gomez-Escribano & Bibb, 2011), конгоцидин (генен клъстер от С. ambofaciens Gomez-Escribano & Bibb, 2011), клоробиоцин (генен клъстер от С. розеохромогени Flinspach et al., 2010), капразамицини (генен клъстер от Streptomyces sp. MK730-62F2 Flinspach et al., 2010 г.), GE2270, тиопептиден антибиотик (генен клъстер от Planobispora rosea Flinspach, Kapitzke, Tocchetti, Sosio, & Apel, 2014) и cacibiocin (генен клъстер от Catenulispora acidiphila Zettler et al., 2014). Наскоро беше публикуван по-изчерпателен списък, илюстриращ химичното разнообразие от съединения, които могат да бъдат произведени от генеричните щамове гостоприемници (Gomez-Escribano & Bibb, 2014).

Подходите за комбинаторна биосинтеза (комбиниране на биосинтетични гени от различни клъстери и пътища) и мутасинтеза (блокиране на биосинтезата на прекурсор и захранване с аналогични или синтетични прекурсори) за производството на нови аналози на специализирани метаболити с модифицирана функционалност също бяха тествани в тези нови, генерични щамове гостоприемници, както и в Act-, Red- и Mmy-отрицателни С. coelicolor щамове M512 и CH999. Например, стотици "неестествени" тиопептиди, получени от RiPP (производни на GE37468) (Young, Dorrestein, & Walsh, 2012), липопептиди, получени от NRPS (CDA производни) (Micklefield, 2009) и аминокумарини (хлоробиоцин производни) 2009 г.), някои от които показват подобрено усвояване на антибиотици и биоактивност. Тези резултати показват, че комбинация от методи е успешна за разширяване на структурното разнообразие на особено пептидно специализирани метаболити, тъй като те често са твърде сложни за ефективна синтетична модификация. Способността да се променят структурните характеристики и биоактивността, което води до получаване на нови лекарства с подобрено фармакокинетично поведение за фармацевтичния тръбопровод, е спешно необходима за ефективно химиотерапевтично лечение на резистентни към лекарства инфекции и рак.


История

Докато нашите научни познания за антибиотиците са развити едва наскоро, практическото приложение на антибиотиците съществува от векове. Първата известна употреба е била от китайците преди около 2500 години. През това време те открили, че прилагането на плесенясала извара от соеви зърна при инфекции има определени терапевтични ползи. Беше толкова ефективно, че се превърна в стандартно лечение. Доказателствата сочат, че други култури са използвали вещества от антибиотичен тип като терапевтични средства. Суданско-нубийската цивилизация е използвала вид тетрациклинов антибиотик още през 350 г A.D. В Европа през Средновековието сурови растителни екстракти и сирене също са били използвани за борба с инфекциите. Въпреки че тези култури са използвали антибиотици, общите принципи на антибиотичното действие не са били разбрани до двадесети век.

Развитието на съвременните антибиотици зависи от няколко ключови индивида, които демонстрираха на света, че материалите, получени от микроорганизми, могат да се използват за лечение на инфекциозни заболявания. Един от първите пионери в тази област е Луи Пастьор. През 1877 г. той и негов сътрудник откриват, че растежът на болестотворни антраксни бактерии може да бъде инхибиран от сапрофитни бактерии. Те показаха, че големи количества антраксни бацили могат да се дават на животни без неблагоприятни ефекти, стига да се дават и сапрофитните бацили. През следващите няколко години други наблюдения подкрепиха факта, че някои бактериално получени материали могат да предотвратят растежа на болестотворни бактерии.

През 1928 г. Александър Флеминг прави един от най-важните приноси в областта на антибиотиците. В експеримент той установи, че щам на зелено Пеницил плесента инхибира растежа на бактерии върху плоча с агар. Това доведе до разработването на първия антибиотик от съвременната ера, пеницилин. Няколко години по-късно през 1932 г. е публикувана статия, която предлага метод за лечение на инфектирани рани с помощта на пеницилинов препарат. Въпреки че тези ранни проби от пеницилин бяха функционални, те не бяха надеждни и бяха необходими допълнителни усъвършенствания. Тези подобрения идват в началото на 40-те години на миналия век, когато Хауърд Флори и сътрудници откриват нов щам на пеницил, които произвеждат високи добиви на пеницилин. Това позволи широкомащабно производство на пеницилин, което помогна за стартирането на съвременната антибиотична индустрия.

След откриването на пеницилина се търсят други антибиотици. През 1939 г. започва работа по изолирането на потенциални антибиотични продукти от почвените бактерии streptomyces. По това време е въведен терминът антибиотик. Selman Waxman и сътрудници откриват стрептомицин през 1944 г. Последващите проучвания доведоха до откриването на множество нови, различни антибиотици, включително актиномицин, стрептотрицин и неомицин, всички произведени от Streptomyces. Други антибиотици, които са открити оттогава, включват бацитрацин, полимиксин, виомицин, хлорамфеникол и тетрациклини. От 70-те години на миналия век повечето нови антибиотици са синтетични модификации на естествено срещащи се антибиотици.


Индустриална биотехнология и стокови продукти

3.52.5 Бъдещи перспективи

Областта на метаболитното инженерство промени техническия пейзаж за множество разнообразни индустриални процеси като алтернативни източници на енергия, производство на химикали и антибиотици, обогатени с хранителни вещества хранителни продукти и терапевтичен протеинов синтез. През последното десетилетие приложенията на метаболитното инженерство значително се развиха, за да задоволят човешките нужди по устойчив начин чрез подобряване на производителността, намаляване на разходите и намаляване на замърсяването. Този напредък може да се дължи на научния и технологичния напредък и тъй като поддържащите дисциплини узреят, по-нататъшното развитие вероятно ще трансформира метаболитното инженерство. Бъдещето на метаболитното инженерство е изключително вълнуващо и неговата посока ще бъде силно продиктувана от разширяването и приемането на нововъзникващата област на синтетичната биология. От инженерна гледна точка синтетичната биология има за цел да даде възможност за систематично напредващо инженерство на биологията за подобрени и нови приложения.

Въпреки това, преди синтетичната биология да бъде напълно реализирана, традиционните биоинженерни дисциплини, включително генетично, протеиново и метаболитно инженерство, трябва да бъдат интегрирани със системната биология. Системната биология е количествен анализ на биологични системи, включващ събиране, анализ и интегриране на набори от данни в мащаб на целия геном за създаване на количествено фенотипно описание на биологичната система. Този подход се различава от традиционната биология, включваща експериментиране, водено от хипотези, чрез анализ на части на компонентите на системата. По подобен начин метаболитното инженерство еволюира от традиционната случайна мутагенеза и стратегии за селекция, до сега изисква многостранен подход, който разчита на мащабни скринингови експерименти и изчислителен анализ на метаболитни и регулаторни мрежи. Следователно има значителен интерес към изследване на клетките и микроорганизмите в контекста на системната биология.

За да се разбере напълно поведението на биологичните системи, различни компоненти трябва да се изучават едновременно по интегративен начин, което изисква аналитична подкрепа и изчислителни инструменти. Неотдавнашното експоненциално увеличаване на наличността на биологична информация за количествено определяне на физиологията е усъвършенствала системната биология, а по-нататъшното откриване и напредъкът зависи от правилните инструменти за интерпретиране на масиви от данни с висока производителност. Характеризирането на биологичните мрежи изисква разработването на математически принципи и подробни карти, изясняващи протеини, РНК, регулатори и други макромолекули. Създават се метаболитни мрежи, регулаторни мрежи и мрежи за взаимодействие на протеини, които ще инициират формулирането на подробни математически модели, които са усъвършенствани от основани на хипотези, итеративни системи, смущения и интегриране на данни. За кратък период от време областта стана свидетел на развитието на високопроизводителна системна биология, принуждавайки изследователите да разглеждат цялостно клетъчните процеси.

Чрез представянето на ново ниво на разбиране и интелектуална рамка за разбиране на биологията от първите принципи, системната биология проправя пътя за синтетичната биология. В de novo проектирането и изграждането на нови биологични системи ще включва изграждане на нови протеини, генетични вериги и метаболитни мрежи от нулата. Понастоящем синтетичната биология е на сравнително ранен етап на развитие с няколко примера, като например създаването на първата клетка, контролирана от синтетичен геном (функционален само с репродуктивни способности), произведен в лабораторията на пионера на геномиката, J. ​​Craig Venter, и рентабилната биосинтеза на артемизинин, антималарийно лекарство, традиционно добито от плантация на A. annua растения, в Е. coli в лабораторията на пионера на синтетичната биология, Джей Д. Кислинг. За да се постигнат синтетични клетки, способни да изпълняват функции, персонализирани да отговарят на човешките нужди, ще са необходими големи мултидисциплинарни групи, работещи заедно по колективни проблеми с общи цели.

В по-широк контекст принципите на метаболитното инженерство също се признават в медицината, където изследователите са предизвикани от интегрирането на данни от пациенти, животински модели и експерименти с тъканна култура. Способностите за интегриране на голям набор от данни, научени от експериментирането на клетъчния метаболизъм, са полезни за изследване на болестни състояния като диабет и затлъстяване, тъй като включват метаболизъм и съхранение на захарта. Освен това измерванията на потока, глобалното профилиране на нивата на транскрипт, протеини и метаболити и моделиране на системно ниво, необходими за изясняване на това как различните подсистеми влияят една на друга и функционират като цяло, могат да бъдат приложени към първични клетки, непокътнати тъкани или телесни течности. Тези инструменти могат да се използват за изследване на инициирането, прогресията и ефектите на лечението, включително молекулярни цели за нови лекарства и маркери за диагностика. Персонализираната медицина, която акцентира върху системното използване на индивидуални данни за пациентите за оптимизиране на превантивните и терапевтични грижи, също ще напредне с бързо прогресиращата област на метаболитното инженерство.


Антибиотици: търговско производство на антибиотици

Антибиотиците са продукт на вторичен метаболизъм, който инхибира процесите на растеж на други организми дори когато се използват в ниски концентрации. Антибиотикът пеницилин е открит от Флеминг през 1929 г.

Въпреки че са изолирани повече от 300 антибиотични съединения, само 123 в момента се произвеждат чрез ферментация. В допълнение, повече от 50 антибиотици се произвеждат като полусинтетични съединения, а три антибиотика, хлорамфеникол, фосфономицин и пиролнитрин, се произвеждат напълно синтетично.

Инокулум:

Високопродуктивният щам е предпоставка за производството на антибиотици. Следователно постоянното подобряване на напрежението е неразделна част от търговските дейности. Инокулумът обикновено се приготвя под формата на суспензия от спори, която се прехвърля във ферментаторите. По правило броят на етапите между консервирания материал и крайния етап на инокулация се свежда до минимум, за да се сведе до минимум рискът организмът да загуби своя висок потенциал за добив.

Ферментатор:

Антибиотиците обикновено се произвеждат във ферментатори от неръждаема стомана, използвани в режим на партида или захранване. Водното охлаждане често се използва за поддържане на температурата между 24-26° C. За повечето производители на антибиотици. Обикновено ферментаторът се поддържа при над атмосферното налягане, което намалява риска от замърсяване и повишава O2 доставка.

За предпочитане е ферментаторът на последния етап да се използва за производство на антибиотици за най-дълъг период от време. Но началните етапи на ферментация са предназначени за значителен микробен растеж, те се извършват във ферментатори на етап семена с по-малък размер. Могат да се използват един или повече етапи на засяване, в зависимост от процеса и щама, за да се получи максимално количество биомаса в правилното физиологично състояние за високо производство на антибиотици, когато се въведе във ферментатора на последния етап.

Среда на производство:

Производството на антибиотици използва различни среди, различни за всеки етап от операцията (Таблица 12.2). Типичната среда има около 10% (w/v) твърди вещества. Като цяло, добивите са много по-високи при сложни среди. В някои случаи се предоставя и подходящ прекурсор за антибиотика, както в случая на производство на пеницилин G, където като прекурсор се използва фенилоцетна киселина или феноксиоцетна киселина. Тъй като антибиотиците са вторични метаболити, производствената среда е проектирана така, че ключов хранителен елемент става ограничаващ на критичен етап за иницииране на вторичния метаболизъм в организма (например глюкоза за производството на пеницилин и фосфат за няколко антибиотици, произведени от Streptomyces.

В повечето производствени процеси производственият ферментатор работи в периодичен режим на захранване, при който хранително вещество, например глюкоза, се добавя непрекъснато по време на ферментацията, за да се увеличи продължителността на производството на антибиотици. Това е придружено от изтегляне на малки количества бульон, за да се провери увеличаването на обема на бульона във ферментатора. Антипенителите се добавят на съответния етап на ферментация. По време на ферментацията се наблюдават избрани микробиологични, физични и химични характеристики, за да се постигне правилен контрол.

В края на крайния производствен етап на инкубация, бульонът съдържа само ниска концентрация (3-35% от общите разтворени вещества в бульона) на антибиотика. Възстановяването на антибиотиците се извършва чрез отделяне на клетките от бульона чрез филтриране или центрофугиране, което е последвано от пречистване.


Причина за резистентност към антибиотици

В миналото антибиотиците са били добавяни към храната за животни, тъй като те предизвикват повишени темпове на растеж (чрез модифициране на баланса на бактериите в червата на животните) и следователно са давали по-голяма рентабилност.

Тази практика обаче е забранена, тъй като води до развитие на резистентност, която може да се предаде на други бактерии.

Когато приемате антибиотици по медицински причини, също е важно да завършете курса на антибиотикасе предписва, за да се увеличи максимално ползата от лечението и да не се позволи оцеляването на някои бактерии, изложени на сублетален концентрация.


Използване на технологията Staby(®) за разработване и производство на ДНК ваксини без ген за антибиотична резистентност

Появата на нови вируси и разходите за разработване на определени ваксини изискват сега да се разработят нови стратегии за ваксинация. ДНК ваксинацията изглежда е особено обещаващ метод. За това приложение, плазмидна ДНК се инжектира в субекта (човек или животно). Тази плазмидна ДНК кодира антиген, който ще бъде експресиран от клетките на субекта. В допълнение към антигена, плазмидът също кодира резистентност към антибиотик, който се използва по време на етапите на изграждане и производство на плазмида. Въпреки това, регулаторните агенции (FDA, USDA и EMA) препоръчват да се избягва използването на гени за резистентност към антибиотици. Delphi Genetics разработи технологията Staby(®), за да замени гена за устойчивост на антибиотици със система за селекция, която разчита на два бактериални гена. Тези гени са малки по размер (приблизително 200 до 300 бази всеки) и следователно кодират два малки протеина. Те присъстват естествено в геномите на бактериите и върху плазмидите. Технологията вече се използва успешно за производство на рекомбинантни протеини за постигане на по-високи добиви и без необходимост от антибиотици. В областта на ДНК ваксините сега имаме първите данни, потвърждаващи безвредността на тази технология Staby(®) за еукариотни клетки и осъществимостта на индустриално производство на ДНК ваксина без антибиотици. Освен това, като доказателство за концепцията, мишките са били успешно ваксинирани с нашата ДНК ваксина без антибиотици срещу смъртоносна болест, псевдобес (предизвикана от Suid херпесвирус-1).

Ключови думи: ДНК ваксина срещу болестта на Ауески Staby без антибиотици ccdA ccdB електротрансфер.


Промишлено производство на β-лактамни антибиотици

Промишленото производство на β-лактамни антибиотици чрез ферментация през последните 50 години е един от изключителните примери за биотехнология. Днес β-лактамните антибиотици, особено пеницилините и цефалоспорините, представляват основните световни биотехнологични продукти със световни продажби на лекарствени форми от

65% от общия световен пазар на антибиотици. През последните пет десетилетия значителни подобрения в производителността на организмите производители, Penicillium chrysogenum и Acremonium chrysogenum (син. Cephalosporium acremonium) и подобрената технология за ферментация доведоха до повишена производителност и значително намаляване на разходите. Понастоящем се оценява, че основните производители на ферментация записват титри на реколтата от 40–50 g/l за пеницилин и 20–25 g/l за цефалоспорин C. Добивите за възстановяване на пеницилин G или пеницилин V сега са >gt90%. Технологията на процеса на химическа и ензимна хидролиза на 6-аминопенициланова киселина или 7-аминоцефалоспоранова киселина също е високоефективна (

80–90%) с нова ензимна технология, водеща до значително намаляване на разходите през последното десетилетие. Европа остава доминиращата производствена област както за пеницилини, така и за цефалоспорини. Въпреки това, поради непрекъснато нарастващите разходи за труд, енергия и суровини, все повече масово производство се премества към Далечния изток, като Китай, Корея и Индия се превръщат в големи страни-производители, като пълнежът на лекарствени форми става все по-доминиращ в Пуерто Рико и Ирландия.

Това е визуализация на абонаментно съдържание, достъп през вашата институция.


Антибиотик: Производство на антибиотици

Масовото производство на антибиотици започва през Втората световна война със стрептомицин и пеницилин. Сега повечето антибиотици се произвеждат чрез поетапна ферментация, при която щамове на микроорганизми, произвеждащи високи добиви, се отглеждат при оптимални условия в хранителна среда във ферментационни резервоари, съдържащи няколко хиляди галона. Мухълът се прецежда от ферментационния бульон и след това антибиотикът се отстранява от бульона чрез филтриране, утаяване и други методи за разделяне. В някои случаи нови антибиотици се синтезират лабораторно, докато много антибиотици се произвеждат чрез химично модифициране на природни вещества, много такива производни са по-ефективни от естествените вещества срещу инфектиращи организми или се усвояват по-добре от тялото, напр. някои полусинтетични пеницилини са ефективни срещу бактерии, резистентни към изходното вещество.

Колумбийската електронна енциклопедия, 6-то изд. Copyright © 2012, Columbia University Press. Всички права запазени.