Информация

Биологична безопасност при обезсмъртяване на клетъчна линия

Биологична безопасност при обезсмъртяване на клетъчна линия


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Клетъчните линии често се обезсмъртяват чрез изкуствена експресия на протеини, които специфично причиняват нокаут на важни гени за потискане на рака или активиране на протоонкогени.

Клетъчното безсмъртие се случва при увреждане на пътищата на контролните точки на клетъчния цикъл (p53/p16/pRb), реактивиране или регулиране на теломеразния ензим или повишаване на регулацията на някои онкогени или онкопротеини, което води до по-висока скорост на клетъчно делене.

Това обаче изглежда попада в обхвата на ниво 3 на биобезопасност, тъй като векторите за експресия на протеини са способни да причинят рак у изследователя, когато заразят изследователя. Ракът със сигурност може да се счита за сериозно или смъртоносно заболяване и аерозолирането на векторите, макар и рядко, не е невъзможно (например по време на разлив).

Според дефинициите за биобезопасност на Колумбийския университет,

Средства: сериозни или смъртоносни заболявания, предавани чрез аерозоли, напр. M. tuberculosis, SARS. Рекомбинантни ДНК дейности, използващи генетичен материал от BSL-3 организми или такива организми като клетки гостоприемници.

Защо тогава CDC класифицира работата на клетъчната линия, включително работата с клетки, произвеждащи вируси, като дейност на BSL-2, изискваща само нива на задържане на BSL-2, когато актът на обезсмъртяване на клетките би включвал работа с вирусни агенти, които могат да причинят рак?

Клетки, обезсмъртени с вирусни агенти като SV-40, EBV аденовирус или HPV, както и клетки, носещи вирусен геномен материал, също представляват потенциални опасности за лабораторните работници. Туморогенните човешки клетки също са потенциални опасности в резултат на самоинокулация.[… ]

Човешките и други клетки на примати трябва да се борави с BSL-2 практики и ограничаване. Цялата работа трябва да се извършва в BSC и целият материал да се обеззарази чрез автоклавиране или дезинфекция преди изхвърляне. Трябва стриктно да се спазват препоръките на BSL-2 за предпазно оборудване на персонала, като лабораторни престилки, ръкавици и защита за очите.

Считат ли се трансформационните клетки (напр. вирусните клетки 293T, съдържащи трансформиращите вируси) за риск от ниво 3 за биологична безопасност и ако не, защо не?


Работата с вектори, експресиращи онкогени или унищожаващи туморни супресорни гени (особено ако векторите са базирани на лентивирус) често се извършва при условия "BSL-2+". Това по същество означава, че се използват лични предпазни мерки, необходими за BSL-3, но не се изискват специализирани вентилационни системи и така нататък от физическото лабораторно пространство на BSL-3. Това изглежда отговаря на въпросите, свързани с безопасността на следователите, повдигнати в този въпрос. Вижте пълната политика на Колумбия като пример за подробностите и процеса на оценка на риска.

Както вече беше отбелязано, след като култивираните клетки са били заразени с тези вектори, рисковете за персонала са значително намалени, ако не са елиминирани, така че тогава са необходими по-малко строги защити.


Може би клетките трябва да се съдържат под BSL-2, а агентите (вирусни частици и т.н.) под по-строг BSL-3? Тоест, след обезсмъртяването можете да държите клетките под по-ниска сигурност.

Ниво на биологична безопасност 2 се основава на BSL-1. BSL-2 е подходящ за работа с агенти, които позират умерени опасности на персонала и околната среда.

Ниво на биологична безопасност 3 е приложимо за клинични, диагностични, учебни, изследователски или производствени съоръжения, където се работи с местни или екзотични агенти, които могат да причинят сериозно или потенциално смъртоносно заболяване чрез инхалационния път на експозиция

CDC Биологична безопасност в микробиологични и биомедицински лаборатории, лабораторни критерии за ниво на биобезопасност

Що се отнася до клетките HEK 293, вижте това:

Практики на ниво 2 на биобезопасност и съоръжения за задържане за всички дейности, включващи клетъчни линии HEK-293.

HEK 293 Оценка на риска от клетъчна линия - IBC


Клетъчни линии: типове, номенклатура, избор и поддръжка (със статистика)

Развитието и различни други аспекти на първичната култура са описани по-горе. Терминът клетъчна линия се отнася до размножаването на културата след първата субкултура.

С други думи, след като първичната култура е субкултивирана, тя се превръща в клетъчна линия. Дадена клетъчна линия съдържа няколко клетъчни линии с подобни или различни фенотипове.

Възможно е да се избере конкретна клетъчна линия чрез клониране или физическо разделяне на клетките или друг метод за селекция. Такава клетъчна линия, получена чрез селекция или клониране, се означава като клетъчен щам. Клетъчните щамове нямат безкраен живот, тъй като умират след някои деления.

Видове клетъчни линии:

Крайни клетъчни линии:

Клетките в културата се делят само ограничен брой пъти, преди скоростта им на растеж да намалее и накрая да умрат. Клетъчните линии с ограничена продължителност на живота на културата се наричат ​​крайни клетъчни линии. Клетките обикновено се делят от 20 до 100 пъти (т.е. е 20-100 удвояване на популацията) преди изчезване. Действителният брой удвоявания зависи от вида, разликите в клетъчната линия, условията на културата и т.н. Човешките клетки обикновено се делят 50-100 пъти, докато миши клетки се делят 30-50 пъти преди да умрат.

Непрекъснати клетъчни линии:

Няколко клетки в културата могат да придобият различна морфология и да се променят. Такива клетки са способни да растат по-бързо, което води до независима култура. Потомството, получено от тези променени клетки, има неограничен живот (за разлика от клетъчните щамове, от които произлизат). Те са обозначени като непрекъснати клетъчни линии.

Непрекъснатите клетъчни линии са трансформирани, безсмъртни и туморогенни. Трансформираните клетки за непрекъснати клетъчни линии могат да бъдат получени от нормални първични клетъчни култури (или клетъчни щамове) чрез третирането им с химически канцерогени или чрез заразяване с онкогенни вируси. На масата. 36.1 се сравняват различните свойства на крайните клетъчни линии и непрекъснатите клетъчни линии.

Най-често използваните термини при работа с клетъчни линии са обяснени по-долу.

Делителят на коефициента на разреждане на клетъчна култура при субкултура. Например, когато всяка субкултура раздели културата наполовина, съотношението на разделяне е 1: 2.

Това е броят пъти, когато културата е била субкултурна.

Отнася се до броя на удвояванията, през които е претърпяла клетъчна популация. Трябва да се отбележи, че номерът на пасажа и номерът на поколението не са еднакви и са напълно различни.

Номенклатура на клетъчни линии:

Обичайна практика е да се дават кодове или обозначения на клетъчни линии за тяхната идентификация. Например, кодът NHB 2-1 представлява клетъчната линия от нормален човешки мозък, последван от клетъчен щам (или номер на клетъчна линия) 2 и клонинг номер 1. Обичайната практика в културната лаборатория е да се поддържа дневник или компютърна база данни файл за всяка от клетъчните линии.

При назоваването на клетъчните линии е абсолютно необходимо да се гарантира, че обозначението на всяка клетъчна линия е уникално, така че да няма объркване, когато се дават доклади в литературата. Освен това, към момента на публикуване, клетъчната линия трябва да бъде с префикс с код, обозначаващ лабораторията, от която е получена, напр. NCI за Национален институт по рака, Wl за институт Wistar.

Често използвани клетъчни линии:

Има хиляди клетъчни линии, разработени от различни лаборатории по света. Избран списък с някои често използвани клетъчни линии заедно с техния произход, морфология и други признаци са дадени в Таблица. 36.2.

Избор на клетъчни линии:

При избора на клетъчна линия трябва да се вземат предвид няколко фактора.

Някои от тях са описани накратко:

Като цяло, нечовешките клетъчни линии имат по-малък риск от биологични опасности, поради което се предпочитат. Въпреки това, разликите между видовете трябва да се вземат предвид, докато се екстраполират данните към хората.

2. Крайни или непрекъснати клетъчни линии:

Културите с непрекъснати клетъчни линии са предпочитани, тъй като те растат по-бързо, лесни за клониране и поддържане и произвеждат по-висок добив. Но е съмнително дали непрекъснатите клетъчни линии изразяват правилните и подходящи функции на клетките. Ето защо някои работници предлагат използването на крайни клетъчни линии, въпреки че е трудно.

3. Нормални или трансформирани клетки:

Трансформираните клетки са предпочитани, тъй като са обезсмъртени и растат бързо.

Наличността на клетъчни линии също е важна. Понякога може да е необходимо да се разработи конкретна клетъчна линия в лаборатория.

5. Характеристики на растеж:

Трябва да се вземат предвид следните параметри на растеж:

и Време за удвояване на населението

ii. Възможност за растеж в суспензия

iii. Плътност на насищане (добив на колба)

Важни са стабилността на клетъчната линия с особено отношение към клонирането, генерирането на адекватен запас и съхранението.

7. Фенотипна експресия:

Важно е клетъчните линии да притежават клетки с правилната фенотипна експресия.

Поддържане на клетъчни култури:

За рутинната и добра поддръжка на клетъчните линии в културата (първична култура или субкултура) изследването на клетъчната морфология и периодичната смяна на средата са много важни.

Клетъчна морфология:

Клетките в културата трябва да се изследват редовно, за да се проверява здравословното състояние на клетките, липсата на замърсяване и всякакви други сериозни усложнения (токсини в средата, недостатъчни хранителни вещества и др.).

Замяна на среда:

Необходима е периодична смяна на средата за поддържане на клетъчните линии в културата, независимо дали клетките са пролифериращи или непролифериращи. За пролифериращите клетки средата трябва да се сменя по-често в сравнение с непролифериращите клетки. Интервалът от време между промените в средата зависи от скоростта на клетъчния растеж и метаболизма.

Например, за бързо растящи трансформирани клетки (например HeLa), средата трябва да се сменя два пъти седмично, докато за бавно растящи нетрансформирани клетки (например IMR-90) средата може да се сменя веднъж седмично. Освен това, за бързо пролифериращи клетки, субкултивирането трябва да се извършва по-често, отколкото за бавно растящите клетки.

За подмяната на средата трябва да се вземат предвид следните фактори:

Културите с висока клетъчна концентрация използват хранителните вещества в средата по-бързо от тези с ниска концентрация, поради което се изисква средата да се сменя по-често за първата.

Понижаването на pH на средата е индикация за смяна на средата. Повечето от клетките могат да растат оптимално при pH 7,0 и почти спират да растат, когато pH падне до 6,5. При по-нататъшен спад на pH (между 6,5 и 6,0), клетките могат да загубят своята жизнеспособност.

Скоростта на спадане на pH обикновено се оценява за всяка клетъчна линия с избрана среда. Ако спадът е по-малък от 0,1 pH единици на ден, няма вреда, дори ако средата не се смени незабавно. Но когато спадът е 0,4 pH единици на ден, средата трябва да се смени незабавно.

Ембрионалните клетки, трансформираните клетки и непрекъснатите клетъчни линии растат бързо и изискват по-често субкултивиране и смяна на средата. Това е в контраст с нормалните клетки, които растат бавно.

4. Морфологични промени:

Честото изследване на клетъчната морфология е много важно в техниките на култивиране. Всяко влошаване на клетъчната морфология може да доведе до необратимо увреждане на клетките. Смяната на средата трябва да се направи, за да се избегне напълно рискът от увреждане на клетките.


Обезсмъртяване и злокачествена трансформация на еукариотни клетки

Процесът на клетъчна трансформация е подробно изследван in vitro с помощта на обезсмъртени клетъчни линии. Обезсмъртените клетки никога нямат нормалния диплоиден кариотип, въпреки това те не могат да растат една върху друга в клетъчна култура (контактно инхибиране), не образуват колонии в мек агар (закрепване-зависим растеж) и не образуват тумори, когато се инжектират в имунодефицитни гризачи. Всички тези характеристики могат да бъдат получени с допълнителни хромозомни промени. Множество генетични пренареждания, включително увеличаване и загуба на брой на цяла хромозома и генни копия, хромозомни транслокации, генни мутации са необходими за установяване на фенотипа на злокачествената клетка. Повечето от експериментите за откриване на трансформираща способност на гени, свръхекспресирани и/или мутирали в тумори (онкогени), бяха проведени с помощта на миши ембрионални фибробласти (MEFs), NIH3T3 миши фибробластни клетъчна линия, човешки ембрионален бъбрек 293 клетъчна линия (HEK293) и човешка клетъчна клетка линии (главно HMEC и MC-F10A). Тези клетъчни линии имат анормални кариотипове и са склонни да прогресират до злокачествено трансформирани клетки. Този преглед е насочен към разбиране на механизмите на обезсмъртяване на клетките от различни "обезсмъртващи агенти", онкоген-индуцирана клетъчна трансформация на обезсмъртени клетки и умерен отговор на напредналите тумори към противоракова терапия в светлината на туморна "онкогенна и хромозомна зависимост", интра- /междутуморна хетерогенност и хромозомна нестабилност.


Обезсмъртяване на клетките

Съществуват няколко метода за обезсмъртяване на клетки от бозайници в условия на култура.
С дългогодишен опит в обезсмъртяването на клетките, нашият партньор ABM разработи най-изчерпателната продуктова линия за обезсмъртяване на клетките, включваща рекомбинантни лентивирусни, ретровирусни (MMLV) и аденовирусни вируси, експресиращи EBV, HPV-16 E6/7 и SV40 T антигени, hTERT, p53 и RB siRNAs и ras & myc мутанти. Всички тези инструменти ще направят вашия проект за обезсмъртяване на клетките по-опростен и по-лесен от всякога.


Вирусна индукция: EBV, HPV E6/7 и SV40 T антиген
Един метод е да се използват вирусни гени, като EBV, HPV-16 E6/7 ген и антигените на Simian Virus 40 (SV40) T, за да се предизвика обезсмъртяване. Доказано е, че SV40 T антигените са най-простият и най-надежден агент за трансформация на много различни типове клетки в културата и механизмът на SV40 T антигените при обезсмъртяване на клетките е добре проучен. В по-голямата си част вирусните гени постигат обезсмъртяване чрез инактивиране на туморните супресорни гени (p53, Rb и други), които могат да индуцират репликативно стареещо състояние в клетките. Последните проучвания показват също, че SV40 T антигенът може да индуцира теломеразна активност в заразените клетки.

hTERT израз
По-скоро открит подход към обезсмъртяването на клетките е чрез експресията на протеина на теломеразата обратна транскриптаза (TERT), особено за клетки, които са най-засегнати от дължината на теломерите (например човешки). Този протеин е неактивен в повечето соматични клетки, но когато hTERT е екзогенно експресиран, клетките са в състояние да поддържат достатъчна дължина на теломерите, за да избегнат репликативно стареене. Анализът на няколко обезсмъртени с теломераза клетъчни линии потвърждава, че клетките поддържат стабилен генотип и запазват критични фенотипни маркери.
Въпреки това, свръхекспресията на hTERT в някои типове клетки (особено в първични епителни клетки) не успява да индуцира обезсмъртяване на клетките и може да предизвика клетъчна смърт.

Инактивиране на гени за потискане на тумора
Последните изследвания установиха, че ко-експресията на hTERT каталитична субединица с p53 или RB siRNA може да обезсмърти човешки първични епителни клетки на яйчниците, осигурявайки по-автентичен нормален клетъчен модел с добре дефиниран генетичен фон (Yang G. et al., Carcinogenesis 2007 Yang G. et al., Oncogene 2007). По същия начин е установено, че свръхекспресията на Ras или Myc T58A мутанти е в състояние да обезсмърти някои първични типове клетки (Sears R. et al., Genes & Dev. 2000). HOX гените (HOXB8, HOXA9 и HOXA10) са семейство транскрипционни фактори, съдържащи хомеодомен, свързани със злокачествени заболявания като остра миелоидна левкемия и остра лимфоидна левкемия. Съответно, свръхекспресията на HOX гените може да се използва за обезсмъртяване на различни хематопоетични клетки, включително макрофаги, хематопоетични прогениторни клетки и миелоидни прогениторни клетки.


Резултати

Сравнение на различни методологии за първична клетъчна култура

Първоначалните проучвания, сравняващи четири различни метода за тъканна култура (подробно в Материали и методи), генерират клетъчни култури от повечето типове тъкани с различна степен на успех. Като цяло методите, използващи ензимно храносмилане за разграждане на тъканта (Методи 1 и 2), са по-успешни от методите, използващи физическо разрушаване. (Методи 3 и 4). Установено е, че метод 2, третиране с трипсин при 4°C за една нощ, е най-ефективният и надежден за генериране на жизнеспособни клетъчни култури в повечето различни видове тъкани. Сравнително дългото инкубационно време в трипсин позволява по-голямо проникване и по-добро смилане на тъканта в сравнение с Метод 1, където третирането с трипсин е при 37°C. Простотата на Метод 2 и неговата възпроизводимост доведоха до приемането на този метод за производството на първична клетъчна култура. Клетъчни култури без замърсители от черва и кожа бяха трудни за установяване поради очевидната трудност при получаването на тъкани, свободни от бактериално и гъбично замърсяване.

Средата за клетъчни култури се оценява в диапазона от тип тъкан за оптимален растеж. Най-малко успешни са опитите за установяване на клетъчна култура от тъкани, отглеждани в среда без серум Xten GO. Установено е, че най-успешната среда за клетъчна култура в повечето видове тъкани е DMEM/F12-Hams. Допълването на среда със серум на прилепи, за разлика от говежди телешки серум, изглежда не оказва никаква разлика за клетъчния растеж и затова телешкият серум е използван от съображения за икономичност и удобство.

Предварителна характеристика на първични клетъчни линии

По време на установяването на първичните клетъчни култури, неприлепнали клетки бяха загубени по време на промени в средата. Само клетки, които са прикрепени към културалната колба, се поддържат и размножават чрез пасаж. Първоначалните първични клетъчни култури, получени от повечето тъкани, са хетерогенни, с различни клетъчни морфологии, наблюдавани (Фигура 1А). Скоростта на растеж на първичните клетъчни култури варира значително, като клетките от аортата, бъбреците и плода нарастват, за да се сливат бързо и изискват преминаване в рамките на 6 дни. За разлика от тях, на мускулите, мозъка и лимфните възли са били необходими до 15 дни, за да достигнат до сливане. Наблюдавани са различни клетъчни морфологии, вариращи от предимно фибробластоподобни клетки, наблюдавани в по-голямата част от тъканите, до кубоидни клетки в култури, генерирани от белия дроб и бъбреците (Фигура 1В). Невронни клетки с дендрити са наблюдавани в култури, генерирани от мозъка.

(A) Клетки, получени от мозък (вляво) и бъбрек (вдясно) след 5 дни в първична клетъчна култура. (B) Клетки, получени от черен дроб (вляво) и бъбрек (вдясно) след 12 дни в първична клетъчна култура.

След като се установят първичните клетъчни линии, клетките от всички типове тъкани (Таблица 1) растат добре и са в състояние да бъдат пасирани няколко пъти. Тъй като клетъчните култури се пасират по-нататък, монослоевете стават по-хомогенни на външен вид и разнообразието от клетъчни типове във всяка култура намалява (Фигура 1В). Типично за почти всички първични клетъчни култури, растежът на необезсмъртени първични клетъчни култури намалява значително за повечето типове тъкани след приблизително 10 пасажа.

Идентичността на клетъчните линии на прилепи, установена в това проучване, беше потвърдена от два независими метода, описани в раздела Методи. Кариотипирането на G-лента демонстрира, че мъжът P. alecto използван за развитие на клетъчна линия има 19 двойки хромозоми, 18 двойки автозоми плюс един X и един Y (данните не са показани), с подобна морфология като тази, докладвана по-рано за жена P. alecto използвайки R-лента [26]. Pteropus-специфичен PCR е разработен и валидиран с помощта на ДНК, извлечена от далака на една жена и един мъж P. alecto както и ДНК, извлечена от HeLa (клетъчна линия от рак на маточната шийка на матката), MDCK (кучешки бъбрек Madin-Darby), PK15 (свиня), Vero (бъбрек на африканска зелена маймуна), CHO (яйчник на китайски хамстер) и сърдечна тъкан на мишка. Докато прогнозираният 454-bp фрагмент е получен за P. alecto ДНК, не е произведен PCR продукт от ДНК пробите на някой от другите пет вида бозайници. Освен това, последователността на P. alecto PCR продукт потвърди, че е силно запазен със същия регион в тясно свързани P. vampyrus геном (данните не са показани).

Обезсмъртяване и клониране

За разлика от клетките на гризачи, които са генетично относително нестабилни [14], нито една от първичните клетъчни линии на прилепите, установени в това проучване, не изглежда да е увековечила спонтанно. Следователно, две стратегии за насочено обезсмъртяване, т.е., вътреклетъчната експресия на SV40T или hTERT, бяха използвани за трансформиране на първичните клетъчни линии на прилепите, разработени в това проучване. И двата гена SV40T и hTERT бяха въведени в клетките на прилепи с помощта на ретровирусна векторна система, което води до стабилна интеграция на въведените гени в клетъчната хромозомна ДНК [27]. Трансформираните клетъчни линии се избират чрез използване на маркера за резистентност към хигромицин, кодиран от векторната ДНК. Експресията на големия Т антиген SV40 беше потвърдена чрез имунофлуоресцентно оцветяване с антитяло и Western blot, съответно (Фигура 2). Експресията на hTERT в трансформирани клетки също се потвърждава, като се използват същите методи (данните не са показани). Петнадесет от 20 първични клетъчни линии бяха обезсмъртени с помощта на подхода за голям Т антиген SV40 и 12 с помощта на подхода hTERT (Таблица 1).

(A) Имунофлуоресцентно оцветяване на P. alecto първични клетки и клетки на далака и бъбреците, трансформирани за откриване на експресия на SV40T антигените. (B) Western blot на нетрансформирани P. alecto първични клетки на далака и бъбреците (ленти 1 и 3, съответно) и трансформирани клетки (ленти 2 и 4) за откриване на експресия на големия Т антиген SV40.

Клонирането на новообезсмъртените клетки се счита за съществена стъпка в установяването на клетъчните линии. Клонирането непременно ще намали хетерогенността на клетъчните типове, присъстващи в клетъчната линия. Ако се извърши оптимално, клонирането ще гарантира, че клетъчната линия е получена от един клетъчен тип. Това е от решаващо значение за производството на клетъчни линии, които имат последователни, възпроизводими характеристики. Успяхме да изолираме единични клетки и да отглеждаме жизнеспособни култури от тези клонирани клетки. Към момента на писане са установени пет клонирани, обезсмъртени клетъчни линии (Таблица 1). В Pteropus произходът на всички клонинги е потвърден от Pteropus-специфичен PCR (описан по-горе). Запасите от всички клонирани клетъчни линии са замразени в течен азот и след това са възкресени. Само клетки, третирани с SV40T или hTERT, могат да бъдат клонирани и преминали повече от 10 пъти, предоставяйки допълнителни доказателства за успешно обезсмъртяване.

Чувствителност към инфекция от вируси Nipah и Hendra

В различните първични клетъчни линии се наблюдават вариации в инфекциозността и производството на вирусен протеин след инфекция с висока множественост с HeV или NiV. Въпреки че всички първични P. alecto клетъчните линии бяха успешно инфектирани както с NiV, така и с HeV, ефективността на инфекцията като цяло беше по-ниска от тази, наблюдавана при контролната инфекция във Vero клетки (данните не са показани). В някои първични клетъчни култури, само малка част от клетките произвеждат откриваемо ниво на експресия на вирусен протеин 24 часа след инфекцията (както се открива чрез флуоресценция, данните не са shwon). Въпреки това, след 48 до 72 часа, всички клетъчни линии произвеждат по-големи количества вирусни протеини и за повечето първични клетъчни линии всяка клетка е била заразена. Само първичната сърдечна клетъчна линия показва ограничена инфекция дори след 72 часа (данните не са показани). Значението на тази очевидна разлика е неясно. По подобен начин при клонирани обезсмъртени клетъчни линии се наблюдава разлика в кинетиката на инфекцията в различните линии. Например, NiV инфектира PaKiT02 клетки (Фигура 3А) произвежда откриваеми нива на вирусен антиген, сравними с тези, наблюдавани в клетките Vero в почти всички клетки 24 часа след инфекцията, докато същата инфекция в клетките PaKiH01 води до по-малко от 25% от клетките, произвеждащи откриваеми вирусни антигени в същия момент от време. Въпреки това, на 48 часа разликите вече не се виждаха.

(A) Сравнение на кинетиката на инфекцията на NiV в три различни клетъчни линии на 24 и 48 часа след инфекцията. (B) Сравнение на ефективността на инфекцията на P. alecto клонирани клетъчни линии за HeV и NiV. Снимките са направени 24 часа след заразяването. И в двете проучвания клетките бяха инфектирани при висока множественост на инфекцията (MOI ≥100), фиксирани със 100% метанол и отстранени от лабораторията на ниво 4 на биобезопасност, преди да бъдат оцветени с HeV G протеин-специфични антитела.

Като цяло, няма видима разлика между HeV и NiV инфекциозността в нито една от първичните клетъчни линии. Въпреки това, отличителна разлика в ефективността на инфекцията се наблюдава при някои клонирани обезсмъртени клетки, като HeV има по-висока ефективност на инфекцията. Както е показано в Фигура 3В, изглежда, че HeV има много по-висока инфекциозност от NiV в клоновете на плода (PaFeT10) и мозъка (PaBrH04), обезсмъртени съответно с SV40T и hTERT.

Индуциране на вродени имунни отговори в клонирани клетъчни линии

Едно от основните приложения на клетъчните линии, установени в това проучване, ще бъде за изследване на вродените имунни отговори на инфекция от вируси както от прилеп, така и от не-прилеп. Като първа стъпка към характеризиране на вродената имунна компетентност на различни P. alecto клетъчни линии, стимулирането на експресия на ген на интерферон тип I чрез поли I∶C беше изследвано в избрани SV40T клонирани обезсмъртени клетъчни линии. Резултатите, представени в Фигура 4 предполагат, че има значителни вариации в увеличаването на експресията на ген на интерферон тип I след лечение с поли I∶C, от по-малко от 10-кратно увеличение на PaFeT07 клетките до повече от 100-кратно увеличение на PaLuT02 клетките. Също така е интересно да се отбележи, че увеличението на IFN-β е по-голямо от това за IFN-α във всички тествани досега клетъчни линии.

Показаните резултати са с кратно увеличение на нивата на IFN-α и IFN-β транскрипт (измерено чрез PCR в реално време) след лечение на P. alecto клонирани и обезсмъртени от SV40 голям Т антиген мозъчни, бъбречни и фетални клетки с 10 µg/ml поли I∶C над базалното ниво на експресия на IFN ген в фалшиво третирани клетки. Лентите за грешки представляват стандартното отклонение на средната стойност, получена от дублиращи се проби.


Биологична безопасност

Приложение

Първични клетки или клетъчни линии от всеки източник, различен от човек или примат

Няма система за управление на аерозолите (AMS) нито един сортировчик

Ex vivo човешки клетки от предварително скринирани групи или човешки клетъчни линии, оценени с BSG 1 от ATCC

Препоръчва се AMS, шкаф за биобезопасност (BSC).

Тъкан от животни, ксенотрансплантирани с неинфекциозни човешки клетки

Първична човешка тъкан, извлечена от клиника, тествана за известни патогени HIV, Hep B, C, EBV, CMV

Генетично проектирани човешки или животински клетъчни линии с различен от трето поколение или по-стар лентивирусен или аденовирусен трансфер на ген

Първични човешки клетки от непроверена група или неизвестна анамнеза на пациента

Първични човешки клетки от инфекциозни пациенти

Ниво на биологична безопасност 1 (BSL1): добре характеризирани агенти, за които не е известно, че причиняват заболяване при здрави възрастни хора и представляват минимална потенциална опасност за лабораторния персонал и околната среда.

Ниво на биологична безопасност 2 (BSL2): агенти с умерена потенциална опасност за персонала и околната среда.

Ниво на биологична безопасност 3 (BSL3): местни или екзотични агенти, които могат да причинят сериозно или потенциално смъртоносно заболяване в резултат на експозиция чрез вдишване (приложимо за клинични, диагностични, учебни, изследователски или производствени съоръжения).

Ниво на биологична безопасност 4 (BSL4): опасни и екзотични агенти, които представляват висок индивидуален риск от лабораторни инфекции, предавани от аерозол, и животозастрашаващи заболявания.

През 2009 г. Международното дружество за усъвършенстване на цитометрията изготви насоки за основните съоръжения за сортиране на клетки, за да помогне при разбирането на рисковете и термините за биологична безопасност. Насоките се фокусираха главно върху най-често срещаните типове клетки и приложения, обработвани от съоръжения за сортиране на клетки:


Реагенти за обезсмъртяване на клетки

Първичните клетки претърпяват краен брой удвоявания на популацията и достигат състояние, наречено репликативно стареене след ограничени клетъчни деления. GeneCopoeia&rsquos Реагентите за обезсмъртяване на клетките използват рекомбинантни лентивирусни гени, носещи гени, като например T антигена на маймунския вирус 40 (SV40), човешкия теломеразен протеин с обратна транскриптаза (hTERT), CDK4, HOXB, HOXA, cMyc, Bmi6 до Educe/HPV обезсмъртяване и значително удължаване на живота на първичните клетки.

Лентивирусните частици GeneCopoeia Lentifect&trade се произвеждат по стандартизиран протокол, използвайки пречистена плазмидна ДНК и патентованите реагенти EndoFectin&trade Lenti (за трансфекция) и TiterBoost&trade разтвор. Протоколът използва трето поколение самоинактивираща се опаковъчна система, отговаряща на изискванията на ниво 2 на биобезопасност.

Частиците Lentifect&trade включват CMV или EF1&alpha промотор за ефективна експресия на гена на индуктор на обезсмъртяване в целеви клетки с маркер за резистентност към пуромицин или хигромицин за селекция на стабилно трансдуцирани клетки. Налични са и лентивирусните частици за обезсмъртяване без антибиотичен селекционен маркер.

Предлагат се под формата на 4 флакона от 25 & microl лентивирусни частици с титри от

1 x 10 8 TU/ml. Lentifect&trade частиците се изпращат върху сух лед и трябва да се съхраняват на &ndash80°C веднага след получаване. Избягвайте повтарящи се цикли на замразяване-размразяване, тъй като това ще намали титрите.

Лентивирусната експресионна конструкция беше валидирана чрез секвениране с пълна дължина, смилане с рестрикционни ензими и валидиране на PCR-размер, като се използват генно-специфични и вектор-специфични праймери. Продуктът е потвърден, че не съдържа бактерии, гъбички и обикновени микоплазма замърсяване.


ОЦЕНКА НА АЕРОЗОЛНОТО СЪДЪРЖАНЕ

Класическият метод за оценка на аерозолното задържане върху сортиращи клетки с отклонени капчици, използващи аерозолен бактериофаг и система за откриване на бактериални тревни площи, е описан в няколко публикации (1, 12, 37, 39). Бактериофагният метод на Т4 за оценка на задържането може също да се комбинира с активно вземане на проби от въздух за изследване на въздуха в помещението (1, 38, 39, 45). Методът за утаяване на Т4 и методът за вземане на проби от активен въздух са описани подробно в Приложение 1. Маркирането на аерозолни капчици с бактериофаги е утвърдена техника, която, при условие че титърът на бактериофага е достатъчно висок, гарантира, че всички капчици, генерирани по време на тестовото сортиране, съдържат Т4. Тъй като Merrill е установил, че един фаг е достатъчен за генериране на една плака (12), анализът осигурява висока чувствителност. Освен това, чрез преброяване на плаките, отчитането на резултатите от задържането е лесно. Този метод е процедура за една нощ, която изисква междинни познания по микробиологични техники и зависи от ефективността на биологичните материали.

Наскоро беше описан нов анализ за измерване на ефективността на аерозолното задържане (42, 43). Методът използва суспензия от силно флуоресцентни меламинови кополимерни смоли, които симулират биологична проба по време на тестовото сортиране. Задържането на аерозоли се измерва чрез поставяне на предметни стъкла за микроскоп около инструмента, където се произвеждат аерозоли и могат да излязат. Слайдовете се изследват за наличие на частици под флуоресцентен микроскоп. Perfetto et al. (40, 44) са увеличили чувствителността и възпроизводимостта на анализа чрез използване на жизнеспособен пробоотборник за микробни частици. Това устройство изтегля въздух от стаята върху предметно стъкло и концентрира събраните частици смола върху областите на предметното стъкло, разположени непосредствено под всмукателните отвори. Тази техника е описана в Приложение 1 и е подходяща за извършване непосредствено преди потенциално биологично опасен сорт, но за тази практика флуоресцентният микроскоп трябва да е лесно достъпен. The highly fluorescent particles can be easily detected, but careful handling of the microscope slides, and the air sampler are important to avoid false positives. Diligent scanning of the entire slide is required to reliably detect escape of a single particle.

Before sorting any unfixed and potentially bio-hazardous specimens on a given instrument, it is imperative to validate that aerosols are contained during the regular sorting process and during instrument failure modes [Appendix 1]. If aerosols are detected outside of containment, then the cell sorter must be modified such that no aerosols are detectable. Contacting the instrument manufacturer for instructions or dispatching a service engineer will be necessary before making any instrument modifications. Testing must also be done whenever changes are made to the cell sorter that may affect escape of aerosols, e.g., installation of a new drive head or flow cell, replacement of the sort chamber door, or alterations in the aerosol management system.

For instruments that are placed into biological safety cabinets, it is imperative that laboratories validate initially at installation the efficiency of aerosol containment of the cabinet before any potentially bio-hazardous sorting experiments are performed. Frequent retesting and monitoring proper functioning of the cabinet is mandatory.

Since every live infectious sort has the potential to create infectious aerosols, verification of aerosol containment should be performed as often as possible. It is strongly recommended to perform testing prior to every infectious cell sort and maintain a record of the results. This practice will assure validation of the aerosol management system to contain aerosols containing potentially infectious pathogens.


Acquiring cell lines

You may establish your own culture from primary cells, or you may choose to buy established cell cultures from commercial or non-profit suppliers (i.e., cell banks). Reputable suppliers provide high quality cell lines that are carefully tested for their integrity and to ensure that the culture is free from contaminants. We advise against borrowing cultures from other laboratories because they carry a high risk of cell culture contamination. Regardless of their source, make sure that all new cell lines are tested for mycoplasma contamination before you begin to use them.

We offer a variety of primary cultures and established cell lines, reagents, media, sera, and growth factors for your cell culture experiments.


Информация за автора

Present address: Genzyme Corporation, Cambridge, 02139, Massachusetts, MA, USA

Present address: Biogen, Inc., Cambridge, 02142, Massachusetts, MA, USA

Принадлежности

Whitehead Institute for Biomedical Research, 9 Cambridge Center, Cambridge, 02142, Massachusetts, MA, USA

Ante S Lundberg, Sheila A Stewart, Brian Elenbaas, Kimberly A Hartwell, Mary W Brooks, Robert A Weinberg & William C Hahn

Cystic Fibrosis/Pulmonary Research and Treatment Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, 27599, North Carolina, NC, USA

Scott H Randell, John C Olsen & Scott W Miller

Department of Adult Oncology, and Department of Medicine, Dana-Farber Cancer Institute, Brigham and Women's Hospital, 44 Binney St., Boston, 02115, Massachusetts, MA, USA

Ante S Lundberg & William C Hahn

Department of Medicine, Harvard Medical School, Boston, 02115, Massachusetts, MA, USA

Ante S Lundberg & William C Hahn

Department of Pathology, Children's Hospital and Harvard Medical School, Boston, 02115, Massachusetts, MA, USA

Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, 02139, Massachusetts, MA, USA


Гледай видеото: Ядро клетки. Видео лекция 3 (Юни 2022).


Коментари:

  1. Manuel

    не си прав. Сигурен съм. мога да го докажа. Пишете на ЛС, ще обсъдим.

  2. Kiktilar

    Извинявам се, но според мен не си прав.

  3. Gubei

    И какво бихме правили без твоята много добра фраза

  4. Tojabar

    Защо вашият ресурс има толкова малък брой?



Напишете съобщение