Информация

Какво представлява оцветяването по Гимза на хромозомите?

Какво представлява оцветяването по Гимза на хромозомите?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Получих въпроса на изпита си и написах следното и не разбирам какво не е наред в него:

Оцветяването по Giemsa е метод за оцветяване на особено малария и други паразитни заболявания. G-лентите се появяват, защото оцветяването по Giemsa се състои от богат на A,T материал, т.е. лош ген, така че се появяват тъмни и бели ленти. Всяка хромозома има уникална реакция към оцветяването по Giemsa, така че се появяват G-ленти.

0 точки. Не разбирам какво не е наред с него, тъй като в коментарите си за същия въпрос на първия ми изпит те написаха и допълнителните въпроси: Какво представляват G-лентите? Как се образуват и защо? Този път отговорих на дадените неща и получих нула оценка.

Вероятно грешката беше, че не отговорих по някакъв начин на въпроса от обхвата на медицинската биология. Не съм сигурен обаче какво точно е.

Как бихте отговорили на въпроса, когато знаете, че курсът е бил за медицинска биология?

Моля, добавете етикета Giemsa.


Giemsa не е специален метод за оцветяване на малария или друг паразит. Оцветява ДНК. Като такъв, той може да се използва за оцветяване на всеки ДНК-съдържащ организъм или, с други думи, всяка известна клетка.

По отношение на неговата конкретна употреба в хромозомните ленти, можете да се обърнете към много онлайн ресурси, като този на Университета на Вашингтон:

Хромозомите в метафаза могат да бъдат идентифицирани с помощта на определени техники за оцветяване, така наречените ленти

(… )

Най-често се използват G-ленти. Те получават името си от боята Giemsa, но могат да бъдат произведени с други багрила. В G-лентите тъмните области са склонни да бъдат хетерохроматични, късно репликиращи и богати на AT. Ярките региони са склонни да бъдат еухроматични, ранно репликиращи и богати на GC.


Вероятно от тук искат нещо като:

За диференциране на ядрена и/или цитоплазмена морфология на тромбоцити, червени кръвни клетки, бели кръвни клетки и паразити. При оцветяване по Райт и Гимза: цитоплазмата изглежда синя, а ядрото е сравнително голямо, ексцентрично разположено и червено. Отделният, пръчковиден, оцветен в червено кинетопласт (специализирана митохондриална структура) съдържа извънядрена ДНК, подредена като катенирани миникръгове и максикръгове.

Според мен въпросът не е точен дали искат горното. Трябваше да бъде: Какво е оцветяването по Гимза на хромозомите морфологично? ако горното нещо е правилно.

Това беше първият курс по медицинска биология, така че отговорът трябва да бъде от него.


Giemsa Stain: Принцип, Процедура, Резултати

Оцветяването по Гимза е вид оцветяване по Романовски, кръстено на Густав Гимза, немски химик, създал разтвор на багрило. Той е предназначен предимно за демонстриране на маларийни паразити в кръвни намазки, но също така се използва в хистологията за рутинно изследване на кръвни намазки.

Употреби на Giemsa Stain

  • Оцветяването по Giemsa се използва за получаване на диференциален брой бели кръвни клетки.
  • Използва се също за диференциране на ядрената и цитоплазмената морфология на различните кръвни клетки като тромбоцити, червени кръвни клетки, бели кръвни клетки.
  • В микробиологията оцветяването по Giemsa се използва за оцветяване на тела на включване Chlamydia trachomatis, Борелия видове и ако петното по Уейсън не е налично, да се оцвети Yersinia pestis. Оцветяването на Giemsa също се използва за оцветяване Histoplasma capsulatum, Pneumocystis jiroveci, Klebsiella granulomatis, Talaromyces marneffei (наричан преди Penicillium marneffei) и понякога бактериални капсули.
  • Това оцветяване се използва и в цитогенетиката за оцветяване на хромозомите и идентифициране на хромозомни аберации. Обикновено се използва за G-ленти (Giemsa-Banding)

Принцип на Giemsa Stain

Оцветяването по Giemsa е диференциално оцветяване и съдържа смес от лазурно, метиленово синьо и еозиново багрило. Той е специфичен за фосфатните групи на ДНК и се прикрепя към местата, където има големи количества аденин-тиминова връзка.

Лазурът и еозинът са киселинни багрила, които променливо оцветяват основните компоненти на клетките като цитоплазмата, гранулите и др.

Метиленовото синьо действа като основно багрило, което оцветява киселинните компоненти, особено ядрото на клетката.

Метанолът действа като фиксатор, както и клетъчното петно. Фиксаторът не позволява по-нататъшни промени в клетките и ги кара да прилепнат към предметното стъкло.

Състав на Giemsa Stain

ПРОЦЕДУРА

А. За вътрешно приготвяне на петна:

  1. Претеглете необходимото количество прахово петно ​​и го прехвърлете в чиста, суха бутилка с вместимост 1 литър. Добавете метанол и разбъркайте добре.
  2. Измерете и добавете глицерол и разбъркайте добре.
  3. Поставете бутилката с петна във водна баня при 50-60°C или при 37°C за до 2 часа с често разбъркване.
  4. Етикетирайте бутилката и я съхранявайте на хладно и тъмно място с плътна запушалка.

ЗАБЕЛЕЖКА: Ако водата влезе в контакт по време на която и да е фаза на приготвяне на петното, петното се разваля, затова използвайте, изсушете стъклените съдове и ги съхранявайте при условия, при които няма да има контакт с вода.

  • Филтрирайте петното с помощта на филтърна хартия Whatman № 1 и разредете с вода, буферирана до pH 7,2, за да получите работни разтвори

Б. За оцветяване на предметни стъкла

Методът за оцветяване, концентрацията и времето за използване на оцветяване варира в зависимост от целта, например при тънки кръвни намазки се използва разреждане 1:20, докато за гъста кръвна намазка се използва разреждане 1:50.

За Тънка кръвна намазка

  1. Фиксирайте изсушеното на въздух филм в абсолютен метанол, като го потопите за кратко (две потапяния) в буркан на Coplin, съдържащ абсолютен метанол.
  2. Извадете и оставете да изсъхне на въздух.
  3. Оцветете с разредено оцветяване по Giemsa (1:20, обем/обем) за 20 минути (За разреждане 1:20 добавете 2 ml от Giemsa към 40 ml буферирана вода в буркан Coplin).
  4. Измийте, като потапяте за кратко пързалката в и от буркан Coplin с буферирана вода (едно или две потапяния).
    Забележка: Прекомерното измиване ще обезцвети филма.
  5. Оставете да изсъхне на въздух във вертикално положение. Наблюдавайте под микроскоп първо при 40X и след това с помощта на лещи с маслена потапяне

За дебели кръвни намазки

  1. Оставете филма да изсъхне добре за няколко часа или за една нощ. Не сушете филмите в инкубатор или на топлина, защото това ще фиксира кръвта и ще попречи на лизирането на червените кръвни клетки.
    Забележка: Ако е необходима бърза диагностика на малария, дебели филми могат да бъдат направени малко по-тънки от обикновено, да се оставят да изсъхнат за 1 час и след това да се оцветят.
  2. НЕ ПОПРАВЯЙ.
  3. Оцветете с разредено оцветяване по Giemsa (1:50, обем/обем) за 50 минути (За разреждане 1:50 добавете 1 ml от Giemsa към 50 ml буферирана вода в буркан Coplin)
  4. Измийте, като поставите филма в буферирана вода за 3 до 5 минути.
  5. Оставете въздуха да изсъхне във вертикално положение и наблюдавайте под микроскоп първо при 40X и след това с помощта на лещи с маслена потапяне

За Chlamydia trachomatis

Следвайте гореспоменатите стъпки, но с разреденото петно ​​с разреждане 1:40 (добавете 0,5 ml изходен разтвор на Giemsa към 19,5 ml буферирана вода) и оставете петното за 90-120 минути.


Кариотипиране, оцветяване по Гимза - (26 август 2014 г.)

Подготвям хромозоми за кариотипиране, защото трябва да знам хромозомния номер на изучавания организъм (мравка).

Така че просто трябва да ги преброя.

Използвах протокол за подготовка на хромозоми, подходящ за мравки (включително лечение с колхицин) и направих стандартно оцветяване по Giemsa.

Но никога не виждам ясни метафазни хромозоми, те по-скоро харесват кръгли мехурчета и се залепват много близо един до друг, така че не мога да преброя. 

Сега прочетох, че Giemsa прави хромозомите обемисти. Може би ако моите хромозоми са много къси, това води до кръгъл им вид?

Не мисля, че е проблем с микроскопа, но не съм сигурен, тъй като снимките не стават твърде ясни. (Имам налично 1600x увеличение)

Някой може ли да препоръча друг метод за оцветяване? Или все пак ми помогнете?

Благодаря ви много предварително!

На първо място ми се струва, че снимката ви не е на фокус. Имате ли опит в използването на микроскоп? Добавихте ли масло за потапяне върху слайда (обективът ви е потопен в масло, прав ли съм?)? Въпреки това бих препоръчал да почистите лещата на обектива, сцената и осветителя много добре.

Освен това, прав си, твоята метафаза е слабо разпространена и хромозомите не са в добро състояние. Бих могъл да предложа някои неща, но всичко се основава на човешки клетъчни култури (не знам дали са приложими. ) За да получите добре разпространени метафази, бих предложил да експериментирате с ΚCL инкубация (по-дълги инкубации). Използвам предварително затоплен KCL и го добавям към клетъчната суспензия бавно  при нежно завихряне.

Инкубацията на митоген може също да повлияе на външния вид на хромозомата и броя на метафазите.

Друго нещо, което може да повлияе на външния вид на хромозомите (удължени хромозоми) и метафазното разпространение, са условията на разпространение на слайда (влажност, стайна температура, както и височината, от която пускате клетъчната си суспензия върху слайдовете). Слайдовете трябва да са студени (съхранявани при -20С в метанол). Според моя опит получавам  добре разпръснати дълги хромозоми при около 65% влажност, при стайна температура под 22C. Времето за сушене не трябва да отнема твърде дълго. Можете да използвате сешоар (на най-ниската скала), но не и да затваряте, защото ще унищожите хромозомите (трябва да експериментирате върху това). Като духате само под определен ъгъл, можете също да подобрите разпространението на метафазата си. Слайдовете също не трябва да изсъхват твърде бързо.

Също така трябва да имате предвид, че някои лекарства и медицински състояния влияят на структурата на хромозомите. Но предполагам, че това не се отнася за вашия случай.

Можете също така да добавите тимидин във вашата клетъчна култура, за да получите удължени хромозоми.

Не знам дали ви помогнах или ви обърках още повече, но разпространението на метафаза е опит и вижте. Разстелете едно по едно предметно стъкло, вземете под внимание всички условия, проверете под микроскопа. ако не работи, направете някои промени и опитайте отново. Късмет! :) 

много благодаря за вашата помощ!

Напълно си прав, трябва да работя върху използването на микроскопа.

Да, добавих масло за потапяне върху слайда.

Ще се опитам да почистя всичко и да подобря снимките.

Благодаря за всичките ви предложения, определено ще изпробвам някои от тях. 

Основният проблем е, че не работя с клетъчна култура.

За подготовка на хромозома, дисекция на мъжки мравки, изолиране на тестисите им и издърпване на тестисите на парчета, за да освободя клетките (всичко вече се случва на слайда). 

Инкубирам в разтвор на колхицин, за да спра мейозата в метафаза. 

KCl не е включен в моя протокол, а вместо това е хипотоничен разтвор на Na3Citrat x 2H2O

Смятате ли, че видът на хипотоничния разтвор има значение?

Следователно не изпускам нищо върху предметното стъкло, тъй като тестисите са толкова малки, че определено бих ги изгубил в епруветка.

Въпреки това ще се опитам да съхранявам слайдовете в -20°C метанол, както предлагате.

Влажността също е добра точка, тя също се споменава в протокола, който използвам, ще опитам и това.

Не съм сигурен за 2 неща, които споменахте: митоген и тимидин:

Не използвам никакъв митоген, тъй като клетките в мъжките тестиси така или иначе се делят. 

Мислите ли, че трябва да го добавя към протокола?

Доколкото знам тимидинът инхибира синтеза на ДНК, нали?

Тъй като вече използвам колхицин за спиране в метафаза, не знам дали да опитам?

След лечение с колхицин използвам поетапно три различни фиксатора: 2 различни смеси етанол-GAA и накрая чисто GAA.

След това нанасям стандартен байц Giemsa. 

Значи смятате, че не е проблем с петното, а с подготовката на хромозомата, нали?

Много съм благодарен за помощта ви!

Знам, че това, което искам да правя, е напълно различно от човешката клетъчна култура, но ще изпробвам вашите предложения!

Да, въз основа на моя опит проблемът не е в Giemsa. 

 Видът на хипотоничния разтвор не би трябвало хипотетично да има значение. Просто бъдете внимателни, причината за продължителна инкубация може също да доведе до загуба на хромозоми (метафазите може да се разпространят твърде много, така че няма да могат да се определят точно броя на хромозомите/метафазата).  

Съжалявам, имах предвид митотични инхибитори като колхицин. Забелязах, че продължителната инкубация влияе върху общия брой метафази и морфологията на хромозомите.

Използват се тимидин и метотрексат, както и други фактори, за да се получат удължени хромозоми (важно при кариотипния анализ чрез G- или R-лента). Но мисля, че това е последното нещо, което трябва да опитам. Както разбирам, вие просто искате да преброите броя на хромозомите на метафаза, така че всъщност не е необходимо да получавате удължени хромозоми, а просто добре разпределени пълни метафази.

Друго важно нещо, което пропуснах да спомена е времето на оцветяване. Винаги оставям моите слайдове да изсъхнат за 24 часа и след това ги оцветявам. Забелязах, че получавам "по-красиви" хромозоми. Понякога също ги изсушавам при 90 C или 65 C за 2-3 минути непосредствено преди оцветяването (един слайд наведнъж, за да намеря кое работи най-добре..). 

Намерих някои статии в интернет, които биха могли да ви помогнат повече от моите предложения, въпреки че вероятно вече ги имате, защото са специфични за хромозомни препарати от мравки.

Благодаря отново за помощта и за документите!

Отчасти познавам документите, протоколът, който използвам, всъщност е от човека от третия документ, така че наистина е специфичен за мравките.

Да, единствената ми цел е да преброя хромозомите, да опозная хромозомния брой на вида. 


Очна алергия

Нийл Пи Барни,. Франк М Грациано, в Очна болест, 2010 г

Патофизиология

Оцветяването по Giemsa от остъргвания от горната тарзална конюнктива ще разкрие еозинофили. Еозинофили (които никога не се намират в нормална тъкан), както и голям брой мононуклеарни клетки присъстват в substantia propria в AKC. Установено е, че тези еозинофили имат увеличен брой маркери за активиране на повърхността си. 42 Броят на фибробластите е увеличен и има повишено количество колаген в сравнение с нормалната тъкан. Това откритие вероятно е от решаващо значение за застрашаващия зрението характер на заболяването. Substantia propria също така демонстрира повишено съотношение на CD4+ към CD8+ Т клетки, В клетки, оцветяване на човешки левкоцитен антиген (HLA)-DR и клетки на Лангерханс. 39 Т-клетъчният рецептор върху лимфоцитите в substantia propria е предимно от α или β подтип. 39 Т-клетъчната популация на substantia propria включва CD4+ клетки на паметта. 43 Th2 цитокини преобладават при алергично заболяване, но лимфоцити с Th1 цитокини са открити в substantia propria на пациенти с AKC. 44

Лабораторните прояви в AKC са показани в Таблица 13.2. Сълзите на пациенти с AKC съдържат повишени количества IgE антитяло, ECP, Т клетки, активирани В клетки, еотаксин, невротоксин, получен от еозинофили (EDN), разтворим IL-2 рецептор, IL-4, IL-5, остеопонтин, инхибитор на макрофаги фактор (MIF) и намалени стойности на Ширмер (56% по-малко от 5 mm). 44–47 Дисфункционален системен клетъчен имунен отговор се демонстрира чрез намаляване или отмяна на клетъчно-медиирания отговор към Кандидаи неспособност на някои пациенти да станат чувствителни към динитрохлоробензен. 48 Освен това, аберациите на вродения имунен отговор се предполагат от повишената честота на колонизация с Стафилококус ауреус. Изолиране на S. aureus от очите (конюнктива, реснички, ръб на клепача) на 80% от пациентите с AKC (но не и от контролни пациенти). 49 Въпреки че не е известно до каква степен това допринася за възпалението на очната повърхност, специфични IgE антитела към S. aureus ентеротоксини са открити в сълзи от пациенти с AKC. 50 Освен това потенциалът на S. aureus продукти на клетъчната стена за активиране на епитела на конюнктивата е предложено in vitro в проучвания, отчитащи експресия и активиране на вродения имунен рецептор, Toll-подобен рецептор-2 чрез екстракт от S. aureus клетъчна стена. 51 Имунооцветяването показва, че конюнктивалните епителни клетки от пациенти с AKC експресират значително повече Toll-подобен рецептор-2, отколкото неалергични пациенти. Въпреки тези in vivo открития, пациентите с AKC, които се подобряват с лечението, не са имали промяна в скоростта на колонизация с S. aureus бактерии. 52 Установено е, че серумът на пациенти с AKC съдържа повишени нива на IgE, 29 IgE към стафилококов В токсин, 52 ECP, 53 EDN, 54 и IL-2 рецептор. 55


Хромозомни ленти..

Видяхме, че хромозомата е кондензирана форма на ДНК. Тази кондензация изисква различни хистонови и нехистонови протеини. Всяка хромозома има възпроизводима ултраструктура. Изследването на хромозомите се нарича цитогенетика.

Фигура 1: Структура на хромозома

Снимките на оцветени хромозоми на клетката могат да бъдат фотографирани и подредени според форма, структура и размери, за да образуват кариограма. Когато са подложени на различни обработки преди оцветяване, хромозомите развиват различни тъмни и светли области под формата на ленти. Обвивката може да се използва за идентифициране на хомоложна хромозома и откриване на различни видове аномалии на хромозомни пренареждания.

Фигура 2: Процедура за оцветяване на хромозоми (с Giemsa)

Има различни техники за оцветяване на хромозоми и постигане на различни видове ленти. Тук споменаваме някои от тях:

1. Оцветяване по Giemsa:

Giemsa е багрило с видима светлина, което свързва ДНК чрез интеркалация. Багрилата за видима светлина са по-стабилни и способни да произвеждат по-ясни ленти от флуорохромите. Оцветяването по Giemsa е смес от катионни тиазинови багрила и анионни еозинови багрила като еозин Y.

Положителните молекули на тиазиновото багрило са по-малки и две молекули от същото бързо се интеркалират в отрицателната ДНК молекула и я оцветяват в синьо. Анионната молекула на еозина след това свързва двете тиазинови молекули и оцветява ДНК в лилаво. Giemsa оцветява по-добре хидрофобните участъци.

Има четири различни типа техники за обвързване, които могат да се направят с помощта на Giemsa: G-ленти, R-ленти, C-ленти & Tобвързване. Във всяка от гореспоменатите техники за оцветяване, Giemsa оцветява различни региони поради разлика в предварителна обработка. Както всички знаем, хистоновите протеини са равномерно разпределени по дължината на хромозомите. Нехистоновите протеини се разпространяват на различни места и са отговорни за свободното или кондензирано състояние на различни области на хромозомите. Свободно опакованите региони или еухроматин региони и плътно опаковани региони са хетерохроматин региони. Процесите на предварителна обработка диференцирано извличат тези протеини, което води до различно оцветени региони.

Това е най-често използваният метод за лентовост за цитогенетичен анализ с оцветяване по Giemsa. Техниката е разработена за първи път от д-р Марина Сибрайт през 1971г.

Фигура 3: Д-р Марина Сибрайт

(Източник на изображението и повече информация за д-р Марина Сибрайт тук)

Клетките са задържани в метафаза, подути (направени тургини), фиксирани, изпуснати и спукани. След това хромозомите се изсушават на въздух и хромозомите се обработват предварително преди оцветяването по Giemsa (фигура 2 в подробности в предишната публикация).

Предварителна обработка:

По време на стандартната G-лента хромозомите се третират леко с протеолитични ензими (трипсин) преди оцветяване с Giemsa. Стандартното протоколно оцветяване на G-лента, когато се следва, дава около 400 и 600 ленти, които да се видят на метафазните хромозоми.

Двата вида ленти, които се наблюдават са

• Положителни G-ленти:

Положителните G-ленти са тъмно оцветените ленти. Тези области са хидрофобни и благоприятстват образуването на тиазин-еозинова утайка. Хидрофобността се дължи на хидрофобните протеини. Протеините са трудни за извличане, тъй като имат повече дисулфидни напречни връзки (Фиг. 4). Тези протеини поддържат регионите по-кондензирани. Те образуват късната репликация хетерохроматин и като цяло са AT-богат регион.

Фигура 4: Дисулфидна връзка и сулфхидрилна група

• Отрицателни G-ленти:

Леко оцветените ленти се наричат ​​отрицателни G-ленти. Тези региони са богати на GC основа двойки. Те са ранно възпроизвеждане еухроматин и са по-малко кондензирани. Протеините, които свързват тези региони, имат повече от сулфхидрили (фиг. 4) и лесно се отстраняват по време на предварителната обработка. Тези области са по-малко хидрофобни и по-малко благоприятни за образуването на тиазин-еозинова утайка.

Фигура 5: Нормален човешки (женски) кариотип. (Източник: Thirumulu Ponnuraj, Kannan. (2011). Цитогенетични техники при диагностициране на генетични разстройства)

Тази техника на обвързване разкрива Богат на GC еухроматин и произвежда положителни ленти, които съответстват на отрицателните G-ленти и обратно. Това дава резултати обратен на стандартната G-лента.

При тази техника обвивката се произвежда от метафазни хромозоми в горещ фосфатен буфер (

87°C) преди оцветяване с оцветяване по Giemsa. Инкубацията причинява денатурация на AT регионите на хромозомите поради ниската точка на топене на тези области (

65°C) в сравнение с тази в GC регионите (

R-лентата помага да се анализира структурата на хромозомни краища, които оцветяват светло с G-лента, но по-тъмно с R-лента.

Фигура 6: Хромозома 1: G-лента, диаграма и R-лента – (Източник на изображение: Claude Léonard, Jean-Loup Huret Атлас по генетика и цитогенетика в онкологията и хематологията)

Петна с C-лента конститутивен хетерохроматин която присъства около центромери от всички човешки хромозоми и е най-разпространен около центромерите на човешки хромозоми 1, 9, 16 и дисталното дълго рамо на Y-хромозомата.

Предварителна обработка:

Предварителната обработка включва три последователни стъпки третиране с киселина (HCl), последвано от алкално третиране (бариев хидроксид) и накрая третиране с горещи соли [физиологичен разтвор на натриев цитрат (SSC)]. Третирането с киселина (HCl) води до отстраняване на пурините. Алкалната обработка (бариев хидроксид или натриев борохидрид) намалява очистените захари. Скъсване на веригата на депуринираните места се получава по време на третиране с разтвор на горещи соли [60°C, физиологичен разтвор натриев цитрат (SSC)]. При това окончателно третиране местата с много повтаряща се последователност устояват на счупването и се ренатурират. Също така са защитени местата с протеини, които имат силно взаимодействие. Следователно, местата, защитени от протеин или имащи силно повтарящи се последователности като центромери, се оцветяват.

Фигура 7: (а) G-лентов кариотип на мъжки Bradypus torquatus (2n = 50) (b) С-лентов кариотип на мъжки Bradypus torquatus. (Източник на изображение: Azevedo N et. al. (2012). BMC evolutionary biology. 12. 36.)

Т-лентите включват оцветяване на теломерни участъци от хромозоми. Хромозомите (предметни стъкла) се инкубират във фосфатен или PBS буфер при 87°C, последвано от оцветяване с разтвор на Giemsa или акридин портокал(OA) . Т-лентите са устойчиви на топлина региони, особено богати на C-G двойки. Те съставляват около 15% от всички ленти, но съдържат около 65% от всички картографирани гени.

Фигура 8: Т ивици

Техники за обвързване с други петна:

Кинакринна горчица е алкилиращ агент, който флуоресцира ярко под UV светлина. Тези ленти се виждат под a флуоресцентен микроскоп. Редуващите се ленти на ярка и тъпа флуоресценция се наричат ​​Q ленти. Ярките ленти са богата на AT област, а тъпите ленти са богата на GC област (подобно на G лентата). Q лентите са полезни за разграничаване на човешката Y хромозома и различни хромозомни полиморфизми, включващи сателити и центромери на специфични хромозоми.

Фигура 9: Q-лента

НИТО ивици

Обвивката на NOR включва оцветяване на “нуклеоларна организираща област” със сребърно оцветяване (разтвор на сребърен нитрат). NOR съдържа rRNA гени. Смята се, че сребърният нитрат се прикрепя към нуклеоларните протеини, а не към рДНК сама по себе си. При хората NOR се намират на късите рамена на хромозомите 13, 14, 15, 21 и 22, съответно на гените RNR1, RNR2, RNR3, RNR4 и RNR5. Те кодират 5.8S, 18S и 28S rRNA. Сребърното петно ​​обикновено оцветява транскрипционно активните rRNA гени. Промените в броя и размера на NOR помагат да се обяснят промените в транскрипционната активност в различна среда и условия.

Фигура 10: Оцветени NOR

(Само за информация:Прочетете как техниката на обвързване позволява да се намери разнообразие във видовете риби

Оцветяване с DAPI/дистамицин А:

Това е техника за флуоресцентно оцветяване за етикетиране на специфична подгрупа от C ленти. DAPI/Distamycin A оцветяване се използва за идентифициране на перицентромерни точки на прекъсване в хромозомни пренареждания и хромозоми, които са твърде малки за стандартните техники за лентовост.

4′-6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) е ДНК-свързващ AT-специфичен флуорохром. което дава синя флуороценция. Дистамицин А е ДНК-свързващ AT-специфичен олигопептиден антибиотик. Предварителната обработка с дистамицин А води до намаляване на флуоресценцията чрез оцветяване с DAPI, позволявайки само на някои специфични области на конститутивния хетерохроматин да флуоресцират ярко.

Фигура 11: Сравнение само между DAPI и DAPI/Distamycin A оцветяване.

Тези ярки ленти включват стесненията на хромозоми 1, 9 и 16, късото рамо на хромозома 15 и дисталната част на Y.

Следователно различните техники за ленти помагат при оцветяването на определени региони тъмно или ярко. Тези региони могат да бъдат сравнени с тези в хомоложни хромозоми или хромозоми на различни индивиди или видове, за да се получи информация за болести, еволюция и произход.

Това е всичко за тази публикация. Надявам се тази публикация да ви хареса, ако да, моля коментирайте, харесайте и споделете!!

Следвайте ни и във Facebook, Twitter, Instagram или изпратете имейл на [email protected]

Прочетете също и други публикации от The Biotech Notes:

За студенти, подготвящи се за CSIR-JRF-NET (живот наука, Индия), ето няколко книги с добри отзиви.

(Източници на изображения: Фигура 8: T ивици Фигура 9: Q ивици Фигура 10: Оцветени NOR Фигура 11: DAPI (Thermofisher) и DAPI/Distamycin A оцветяване)


Какво е оцветяването на Giemsa? (със снимки)

Оцветяването по Giemsa е стандартизирана смес от багрила, която прави различни типове клетки ясно откроени в кръвна намазка или тънък парче тъкан. Това петно ​​е кръстено на немския химик Густав Гимза, който за първи път го е разработил за работата си по изучаването на паразита, който причинява малария - плазмодий. За да се гарантира, че техникът, който изследва пробата, може да получи точно отчитане, стъпките на процедурата за оцветяване трябва да бъдат стандартизирани, както и сместа от багрила. Оцветяването по Giemsa се нарича диференциално оцветяване, защото произвежда различни цветове в зависимост от това с какво се свързва, като цитоплазма или ДНК.

Формулата за оцветяване Giemsa е коригирана с течение на времето, за да се подобри стабилността на багрилата и цветовете, които се получават. Настоящите стандартни смеси включват метиленово синьо, еозин и понякога лазур В. Тези багрила често се съхраняват в суха прахообразна форма и се смесват с вода точно преди да бъдат използвани. Ако в сместа за боядисване има вода, преди да се използва, някои от съединенията ще се окислят и оцветят неправилно.

Точните стъпки на процедурата за използване на оцветяване по Giemsa могат да варират в зависимост от това за кой организъм или клетъчен тип се изследва пробата, както и от състава на самата проба. Проба, която ще бъде оцветена с оцветяването по Giemsa, обикновено се намазва или прикрепя към предметно стъкло много скоро след като бъде събрана. Тънката кръвна намазка обикновено се фиксира чрез потапяне в метанол, докато плътната кръвна намазка просто се оставя да изсъхне напълно при стайна температура. След това слайдът се накисва в петното за определено време и след това се изплаква с вода с неутрално pH. Слайдовете се оставят да изсъхнат на въздух преди гледане.

Поради диференциалното оцветяване, произведено от оцветяването по Giemsa,плазмодий цитоплазмата оцветява светлосиньо, докато ДНК изглежда червено или лилаво. Друг паразит, Giardia lamblia, е оцветен в розово-лилаво, с изключение на ДНК, която оцветява много тъмно синьо. Histoplasma capsulatum, гъба, се намира в дрожди в човешки бели кръвни клетки и оцветява в тъмносиньо.

Този процес на оцветяване е полезен и при хромозомни изследвания и при визуализиране на разликите между различните кръвни клетки. Хромозомата оцветява много тъмно синьо в някои участъци и светлосиньо в други. Това причинява лентов ефект, който помага на генетиците да намерят места, където хромозомите са преминали през необичайни промени. Червените кръвни клетки се оцветяват в розово, докато гранулите в мастоцитите се показват като лилави петна. Белите кръвни клетки оцветяват различни нюанси на синьото, което позволява различните типове – базофили, еозинофили, неутрофили и други – да бъдат разграничени един от друг.


Какво представлява хромозомната лента? (със снимки)

Хромозомните ленти са напречните ленти, които се появяват върху хромозомите в резултат на различни техники за диференциално оцветяване. Диференциалните петна придават цветове на тъканите, така че да могат да се изследват под микроскоп. Хромозомите са нишковидни структури от дълги филаменти на дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК), които се навиват в двойна спирала и са съставени от генетична информация или гени, които са подредени кръстосано по дължината.

За да се анализират хромозомите под микроскоп, те трябва да бъдат оцветени, когато са подложени на клетъчно делене по време на мейоза или митоза. Митозата и мейозата са процеси на клетъчно делене, които са разделени на четири фази. Тези фази са профаза, метафаза, анафаза и телофаза.

Критогенетиката е изследване на функцията на клетките, структурата на клетките, ДНК и хромозомите. Той използва различни техники за оцветяване на хромозоми, като G-ленти, R-ленти, C-ленти, Q-ленти и Т-ленти. Всяка техника на оцветяване позволява на учените да изучават различни аспекти на моделите на хромозомни ленти.

Обвивката на Giemsa, известна още като G-лента, позволява на учените да изследват хромозоми в метафазния стадий на митоза. Метафазата е вторият етап на митозата. В тази фаза хромозомите са подредени и прикрепени към центровете или техните центромери и всяка хромозома се появява във форма на X.

Преди да нанесете оцветяване върху хромозомите, те първо трябва да бъдат третирани с трипсин, което е храносмилателна течност, намираща се в много животни. Трипсинът ще започне да усвоява хромозомите, което им позволява да приемат по-добре оцветяването по Giemsa. Петното по Giemsa е открито от Gustav Giemsa и е смес от метиленово синьо и червено киселинно багрило, еозин. Използване на Q-лента хиникрин, което е разтвор тип горчица. Той дава резултати, които са много подобни на Giemsa, но има флуоресцентни качества.

ДНК се състои от четири основни киселини, които се появяват по двойки - аденин, съчетан с тимин, и цитозин с гуанин. Оцветяването по Giemsa създава модели на хромозомни ленти с тъмни зони, богати на аденин и тимин. Светлите зони са богати на гуанин и цитозин. Тези области се възпроизвеждат рано и са евхроматичен. Euchromatic е генетично активна зона, която се оцветява много леко с бои.

Обратното обвързване или R-лентата произвежда модели на хромозомни ленти, които са противоположни на G-лентите. По-тъмните зони са богати на гуанин и цитозин. Той също така произвежда еухроматични части с високи концентрации на аденин и тимин.

При C-лентите оцветяването по Giemsa се използва за изследване конститутивен хетерохроматин и центромера на хромозома. Конститутивните хетерохроматини са области близо до центъра на хромозомата, които съдържат силно кондензирана ДНК, която е склонна да е транскрипционно безшумна. Центромерът е областта в самия център на хромозомата.

Т-лентата позволява на учените да изследват теломерите на хромозомата. Теломерите са капачките, които са на всяка от хромозомите. Те съдържат повтаряща се ДНК и са предназначени да предотвратят евентуално влошаване.

След като хромозомите са оцветени с Giemsa, изследователите могат ясно да видят редуващите се модели на тъмни и светли хромозоми, които се получават. Чрез преброяване на броя на лентите, кариотип на клетка може да се определи. Кариотипът е характеризиране на хромозомите за даден вид според размера, вида и броя.


Съдържание

Той е специфичен за фосфатните групи на ДНК и се прикрепя към области на ДНК, където има големи количества аденин-тиминова връзка. Оцветяването по Giemsa се използва в Giemsa banding, обикновено наричано G-banding, за оцветяване на хромозоми и често се използва за създаване на кариограма (хромозомна карта). Той може да идентифицира хромозомни аберации като транслокации и пренареждания. [ необходимо цитиране ]

Оцветява трофозоита Trichomonas vaginalis, който се представя със зеленикав секрет и подвижни клетки при мокра подготовка. [ необходимо цитиране ]

Giemsa stain is also a differential stain, such as when it is combined with Wright stain to form Wright-Giemsa stain. It can be used to study the adherence of pathogenic bacteria to human cells. It differentially stains human and bacterial cells purple and pink respectively. It can be used for histopathological diagnosis of the плазмодий species that cause malaria [2] and some other spirochete and protozoan blood parasites. It is also used in Wolbachia cell stain in Drosophila melanogaster. [ необходимо цитиране ]

Giemsa stain is a classic blood film stain for peripheral blood smears and bone marrow specimens. Erythrocytes stain pink, platelets show a light pale pink, lymphocyte cytoplasm stains sky blue, monocyte cytoplasm stains pale blue, and leukocyte nuclear chromatin stains magenta. It is also used to visualize the classic "safety pin" shape in Yersinia pestis.

Giemsa stain is also used to visualize chromosomes. This is particularly relevant for detection of Cytomegalovirus infection, where the classical finding would be an "owl-eye" viral inclusion. [3]

Giemsa stains the fungus Histoplasma, хламидия bacteria, and can be used to identify mast cells. [4]

Giemsa's solution is a mixture of methylene blue, eosin, and Azure B. The stain is usually prepared from commercially available Giemsa powder.

A thin film of the specimen on a microscope slide is fixed in pure methanol for 30 seconds, by immersing it or by putting a few drops of methanol on the slide. The slide is immersed in a freshly prepared 5% Giemsa stain solution for 20–30 minutes (in emergencies 5–10 minutes in 10% solution can be used), then flushed with tap water and left to dry. [5]


Sequence organization was revealing by heating DNA to a single-stranded state then allowing the DNA to reanneal by cooling.
This revealed several types of repetitive DNA.
Multiple "copies" of similar functional repetitive sequences can be described as dispersed gene families (globin genes, actins, tubulins).
Non-functional copies of genes are known as pseudogenes.
Tandem gene family arrays are made up of multiple copies of the same gene all next to each other (such as histones).
The nucleolar organizer, which is cytologically distinct, is a tandem array of genes that encode ribosomal RNA.
Noncoding functional sequences, such as the short tandem repeats that act to maintain the telomeres at the ends of a linear chromosome.

There are a number of sequences with no known function include
1) Highly repetitive centromeric DNA including satellite DNA.
2) Variable number tandem repeats (VNTRs) or minisatellite DNA which provide the differences in DNA used in DNA fingerprinting.
3) Microsatellites, regions of dinucleotide repeats

Transposed sequences are "jumping genes" that are dispersed throughtout the genome.
Transposons move as DNA elements and retrotransposons move via an RNA intermediate which is reverse transcribed and reinerted into the genome.
Examples of a retrotransposons include the 1-to 5 kilobase Long interspersed elements (LINES) and the much smaller (>200 basepairs) short interspersed elements (SINES)
Such as the human Alu sequences.
The presence of these various elements provides a great deal of variety to the spacing and locations of genes in the genomes of organisms.


The involvement of nucleosomes in Giemsa staining of chromosomes. A new hypothesis on the banding mechanism

A new hypothesis is proposed on the involvement of nucleosomes in Giemsa banding of chromosomes. Giemsa staining as well as the concomitant swelling can be explained as an insertion of the triple charged hydrophobic dye complex between the negatively-charged super-coiled helical DNA and the denatured histone cores of the nucleosomes still present in the fixed chromosomes. New cytochemical data and recent results from biochemical literature on nucleosomes are presented in support of this hypothesis. Chromosomes are stained by the Giemsa procedure in a purple (magenta) colour. Giemsa staining of DNA and histone (isolated or in a simple mixture) in model experiments results in different colours, indicating that a higher order configuration of these chromosomal components lies at the basis of the Giemsa method. Cytophotometry of Giemsa dye absorbance of chromosomes shows that the banding in the case of saline pretreatment is due to a relative absence of the complex in the faintly coloured bands (interbands). Pretreatment with trypsin results in an increase in Giemsa dye uptake in the stained bands. Cytophotometric measurements of free phosphate groups before and after pretreatment with saline, reveal a blocking of about half of the free phosphate groups indicating that a substantial number of free amino groups is still present in the fixed chromosomes. Glutaraldehyde treatment inhibited Giemsa-banding irreversibly while the formaldehyde-induced disappearance of the bands could be restored by a washing procedure. These results correlate with those of biochemical nucleosome studies using the same aldehydes. Based on these findings and on the known properties of nucleosomes, a mechanism is proposed that explains the collapse of the chromosome structure when fixed chromosomes are transferred to aqueous buffer solutions. During homogeneous Giemsa staining reswelling of the unpretreated chromosome is explained by insertion of the hydrophobic Giemsa complex between the hydrophobic nucleosome cores and the superhelix DNA. Selective Giemsa staining of the AT-enriched bands after saline pretreatment is thought to be due to the, biochemically well-documented, higher affinity of arginine-rich proteins present in the core histones for GC-enriched DNA, which prevents the insertion of the Giemsa complex in the interbands. Production of Giemsa bands by trypsin pretreatment can be related to the action of this enzyme on the H1 histones and subsequent charge rearrangements.(ABSTRACT TRUNCATED AT 400 WORDS)


Giemsa banding (GTG, GTW, GAG, GTL)

The introduction of Giemsa banding (G‐bands) in 1971 by Sumner et al. was another major advance in the field of cytogenetics. It eliminated the need for an expensive fluorescence photomicroscope and provided permanently stained slides with very high‐resolution bands. Today, Giemsa banding (or similar Romanowsky dyes) is the most widely utilized staining technique for chromosome analysis.

In human chromosomes, the 30‐nm fiber of DNA forms loops of approximately 75–100 kb, which are tethered or anchored at their bases to form what is known as a chromosome scaffold. This structure can be seen by removing most histones and non-histones from the chromosomes and surface‐spreading them appropriately for electron microscopy. The residual structure appears as a scaffold, with numerous and extensive loops of DNA radiating from a coarsely fibrous structure that resembles a metaphase chromosome. The final packaging of the 30‐nm fiber of DNA into chromosomes results in a 10,000‐fold reduction in DNA length. Fixation in 3 : 1 methanol‐acetic acid is an important preliminary step for G‐banding. Fixation extracts a portion of all histones, especially H1, and a group of non-histones in the 50,000‐ to 70,000‐dalton (Da) range, but it is far from a complete removal of proteins. The crosslinking data indicated that the conformation of chromosomal proteins in relation to DNA strongly influences banding.

Giemsa stain is a complex mixture of dyes that may vary in concentration, purity, and ratio. The main components are the basic aminophenothiazine dyes – azure A, azure B, azure C, thionin, and methylene blue‐and the acidic dye, eosin. The thiazin dyes vary in the number of methyl groups attached to a core of two benzene rings bound together by nitrogen and a sulfur atom. Several studies have been done concerning the band‐producing ability of the individual components of Giemsa stain. Methylene blue or any of the azures alone produces banding.

Chromatin is divided into two main groups: heterochromatin and euchromatin. Constitutive heterochromatin is highly condensed, very repetitive, and transcriptionally inactive during interphase, in order for gene transcription to occur. One type of euchromatin, facultative heterochromatin, behaves like heterochromatin in a developmentally controlled manner, being transcriptionally inactive, late replicating, and condensed during interphase. The inactive X chromosome in the somatic cells of female mammals is an example of facultative heterochromatin.

G banding requires methanol/acetic acid‐fixed cells spread onto slides cytoplasmic background interferes with good G‐bands, so proper cell dilution and spreading is essential. Slides are sufficiently dried (for 2–4 days at room temperature), or baked at low temperatures (e.g., 60 °C) for 2–18 hours, or high temperatures (e.g., 90–95 °C) for 20–60 minutes to dehydrate them (see Table 6.4). Slides that are insufficiently “aged” by natural means or by heating will not respond at all to the trypsin, no matter how long it is applied, and the chromosomes will appear unbanded.

Трипсин exposure depends on its brand, concentration, and temperature, but may also be affected by preparation and working conditions. Recrystallized forms have a higher level of activity, thereby requiring less time or a lower concentration. A stock trypsin solution can be prepared in advance, and small aliquots can be frozen until needed. At lower temperatures, the working solution has decreased activity. Higher pH (approximately 8) and higher temperature increase the enzymatic action of the trypsin and may be useful with cells that appear to be resistant to standard concentrations. Exposing slides to trypsin in a vertical fashion (rather than horizontal) may enhance its activity slightly.

А fetal bovine serum rinse is helpful in stopping the action of the trypsin. Serum contains alpha‐1‐antitrypsin, which inhibits the trypsin by complexing it with the protein in the serum. Other rinses that are commonly used include pH 8.0 buffer, 0.85% (normal) saline, Hanks’ balanced salt solution (HBSS), and 70% ethanol.

Determination of G‐banded chromosome resolution

As a rule, the better the banding resolution is, the better will be the chance of finding a small chromosome abnormality. This rule is more reliable for deletions and duplications than for centromere displacement (inversions, neocentromeres) because the constriction of the centromere becomes more difficult to visualize as the chromosomes become longer and thinner. However, there is a need to quantify the banding resolution of a given cell (on the analysis sheet) or chromosome study (on the final report) so that the limits of resolution can be inferred. There are several methods for determination of band levels.

The Vancouver method involves counting bands in segments for some chromosomes (e.g., chromosomes 1, 11, and 12) and all bands in others (chromosomes 10 and X). Count only G‐positive bands and do not count the centromere. Total the bands then look at a chart that has increments of 50 bands at the lower range and 100 bands at the higher end to determine haploid band resolution.

хромозомаResolution 350Resolution 450Resolution 550Resolution 850
1p31-p321133
10551219
11p2256
12q45814
х681218
Обща сума18214060
Haploid band resolution determination by the Vancouver method

Johnson and Stallard method

Johnson and Stallard used a method that quantifies the number of light and dark G‐bands present on one chromosome 10. Some laboratories account for a difference in resolution between the two chromosome 10 homologues in a cell by counting both homologues and dividing the total by 2 before using the haploid parameters.

No of bands presentHaploid banding level
12375
13-14400
15-16425
17-18450
19-21475
22-23500
24-25525
26-28550
29575
30600
31625
32650
33675
34700
35725
36750
37775
38800
39825
40-41850
Haploid band resolution determination using chromosome 10 by the Johnson and Stallard method

Welborn method

The Welborn method involves counting all dark and light bands on one homologue each of chromosomes 1 and 2, counting the centromere as a band in each arm. Total the bands from both chromosomes and then multiply by 6 to get the haploid band resolution, since chromosomes 1 and 2 represent 1/6 of the genome.



Коментари:

  1. Kody

    Силно съгласен с предишния пост

  2. Fenrijora

    Вие сте ударили марката. In it something is also to me it seems it is very good idea. Completely with you I will agree.

  3. Vukazahn

    You hit the mark. It seems to me a good thought. Съгласен съм с теб.

  4. Wambleesha

    Поемате грешка. Мога да защитя позицията. Пишете ми в PM, ние ще общуваме.

  5. Stevyn

    Съгласен съм, това е страхотна информация.

  6. Gogul

    Според моето нечие писмо - alexia :)

  7. Onyebuchi

    Curious topic



Напишете съобщение